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摘要目的：<br>　　脓毒症是病原体感染诱发的全身严重的炎症反应，是导致危重症患者死亡的重要原因之一。细胞焦亡是一种不同于凋亡的细胞程序性死亡方式，在脓毒症的发生发展过程中起着重要作用，但其机制仍不明确。MicroRNA（miRNA）是一种内源性非编码小RNA，是病理生理过程中重要的调控因子，参与调控炎症因子的表达与释放、细胞死亡等，近年来研究发现miRNA在脓毒症中发挥重要调节作用，且可以通过调控细胞焦亡进而调控脓毒症。最近研究发现miR-146b-5p是在脓毒症中表达上调，具有促炎作用，但是否在脓毒症细胞焦亡的中发挥作用尚无研究。本研究拟探讨miR-146b-5p在LPS与ATP共同诱导的小鼠原代腹腔巨噬细胞焦亡中的作用及其机制。<br>　　方法：<br>　　1.分离小鼠原代腹腔巨噬细胞，用光学显微镜观察形态；Wright-Giemse染色和流式细胞术检测纯度。<br>　　2.LPS与ATP共同诱导小鼠原代腹腔巨噬细胞焦亡的最佳浓度及时间点的筛选：使用500ng/ml的LPS刺激巨噬细胞24h后再使用3mmol/l、4mmol/l、5mmol/l和6mmol/l的ATP分别作用1h、2h、4h和6h后，用流式细胞术检测各组焦亡发生率，用LDH释放实验检测各组LDH释放水平。<br>　　3.验证LPS与ATP共同诱导的巨噬细胞焦亡：将纯化后的巨噬细胞分为control组、LPS组、ATP组和LPS+ATP组，Westernblot检测GSDMD、caspase-1、cleavedcapase-1、caspase-11、cleavedcaspase-11、NLRP3、ASC、pro-IL-1β、pro-IL-18、HMGB1和caspase-3蛋白的表达水平；ELISA检测培养上清中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10的表达水平；激光共聚焦显微镜观察焦亡关键蛋白GSDMD-N的荧光表达强度；光学显微镜、透射电镜和扫描电镜观察巨噬细胞焦亡形态。<br>　　4.验证miR-146b-5p对LPS与ATP共同诱导的巨噬细胞焦亡的调控作用：用LPS与ATP刺激转染了mimicNC、miR-146b-5pmimic、inhibitorNC和miR-146b-5pinhibitor的小鼠原代腹腔巨噬细胞，qRT-PCR验证miR-146b-5p的转染效率。实验分为control组、LPS+ATP组、miR-146b-5pinhibitor+LPS+ATP组、inhibitorNC+LPS+ATP组、miR-146b-5pmimic+LPS+ATP组和mimicNC+LPS+ATP组；用Westernblot检测GSDMD、caspase-11、ASC和NF-κB蛋白表达情况；ELISA检测培养上清中炎症因子IL-6和IL-1β表达情况；激光共聚焦显微镜观察焦亡关键蛋白GSDMD-N荧光表达情况。<br>　　5.构建NF-κB3’-UTR区报告基因质粒和突变报告基因质粒，通过双荧光素报告基因实验验证miR-146b-5p是否直接调控NF-κB。<br>　　结果：<br>　　1.光学显微镜显示巨噬细胞生长状况良好；Wright-Giemse染色结果显示符合巨噬细胞形态；流式细胞术结果显示巨噬细胞的纯度可达90%。<br>　　2.流式和LDH释放实验结果显示500ng/ml的LPS刺激巨噬细胞24h后再使用5mmol/l的ATP刺激4h为诱导巨噬细胞焦亡的最佳组合方式。<br>　　3.Westernblot结果显示LPS+ATP组的GSDMD、caspase-1、cleavedcaspase-1、caspase-11、cleavedcaspase-11、NLRP3、ASC、pro-IL-1β、pro-IL-18和HMGB1的表达量明显高于对照组（Plt;0.05），凋亡相关蛋白caspase-3的表达量各组没有明显差异；ELISA结果显示LPS+ATP组培养上清中的IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α的表达量显著高于对照组（Plt;0.05）；激光共聚焦结果显示LPS+ATP组GSDMD-N荧光表达量显著高于对照组（Plt;0.05）；LPS+ATP组在光学显微镜下和电镜下观察到明显的焦亡特征。<br>　　4.QRT-PCR表明miR-146b-5p转染效果良好；Westernblot结果显示miR-146b-5p能够有效正调控焦亡相关蛋白GSDMD、ASC、NF-κB和caspase-11的表达，差异具有统计学意义（Plt;0.05）；ELISA结果显示miR-146b-5p能够有效正调控炎症因子IL-6和IL-1β的表达水平，差异具有统计学意义（Plt;0.05）；激光共聚焦结果显示，miR-146b-5p能够有效正调控GSDMD-N蛋白与胞膜的结合，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。<br>　　5.双荧光素酶报告基因检测结果表明miR-146b-5p可直接调控NF-κB。<br>　　结论：<br>　　1.本实验成功提取了小鼠原代腹腔巨噬细胞，并确定500ng/mlLPS刺激24h后5mmol/lATP刺激4h为诱导巨噬细胞焦亡的最佳浓度及时间，成功构建了稳定的体外细胞焦亡模型。<br>　　2.本实验发现miR-146b-5p在LPS与ATP诱导的细胞焦亡中上调，具有正调控作用；并能促进焦亡相关蛋白GSDMD、ASC、caspase-11和NF-κB的表达；促进炎症因子IL-6和IL-1β的释放。<br>　　3.NF-κB是miR-146b-5p直接调控的靶基因。