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摘要目前，肺癌是世界上死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（NSCLC）又是肺癌中最为多见的类型，且晚期患者的转移扩散率达到70%。化疗是癌症治疗的最常见手段，但是由于传统化疗药物引起的毒副作用和肿瘤多药耐药以及实体瘤的缺氧微环境会严重影响治疗效果和临床应用。本文旨在制备一种新型靶向药物运载系统，通过特异性识别肺癌细胞，改善肿瘤缺氧微环境，增强化疗联合超声治疗肺癌的效果，为肺癌的治疗提供一种新策略。<br>　　目的<br>　　通过制备编码AS1411适配体序列和载药序列并包载辣根过氧化氢酶（HRP）和阿霉素（DOX）的DNA纳米花，探究其联合超声对NSCLC的治疗效果和治疗机制，有望为转移率高、疗效不佳的NSCLC提供一种有效的治疗手段。<br>　　方法<br>　　1.编码AS1411适配体序列和载药序列并包载HRP和DOX的DNA纳米花的制备及特性检测：①通过滚环扩增反应制备包载HRP的DNA纳米花（HRP-DFs），并负载DOX制备DOX/HRP-DFs。②通过2%琼脂糖凝胶电泳对DOX/HRP-DFs进行表征；用马尔文激光粒度仪检测DOX/HRP-DFs的粒径与Zeta电位；用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察DOX/HRP-DFs的外部形貌与内部结构；用能量色散X线光谱（EDS）分析DOX/HRP-DFs的元素组成。③用2%琼脂糖电泳检测DOX/HRP-DFs在胎牛血清（FBS）和DNA酶I（DNaseI）中的稳定性。④用紫外分光光度计分别检测DOX/HRP-DFs中HRP和DOX的载药量、HRP的催化活性和DOX的体外药物释放量。⑤用便携式溶氧仪检测DOX/HRP-DFs的产氧量；紫外分光光度计检测DOX/HRP-DFs经超声辐照后的活性氧产量。<br>　　2.DOX/HRP-DFs联合超声对体外LLC细胞的抑制作用及机制：后续实验选用频率为1MHz，声强为1W/cm2的超声设备辐照3min。①用CCK-8法检测DOX/HRP-DFs对人正常支气管上皮样细胞（16HBE）和LLC的细胞毒性。用激光共聚焦（CLSM）和流式细胞仪检测②DOX/HRP-DFs对LLC细胞和16HBE细胞的靶向能力；③DOX/HRP-DFs联合超声在LLC细胞内活性氧（ROS）的产量以及④DOX/HRP-DFs联合超声诱导LLC细胞凋亡的情况。⑤用CLSM观察DOX/HRP-DFs缓解LLC细胞胞内缺氧的情况。⑥用划痕实验和Transwell小室实验研究DOX/HRP-DFs联合超声抑制LLC细胞迁移侵袭的能力。<br>　　3.DOX/HRP-DFs联合超声对C57BL/6小鼠皮下LLC肺癌的治疗效果及机制：①将健康雄性C57BL/6小鼠红细胞与不同浓度DOX/HRP-DFs共同孵育，测量溶血率。②建立LLC肺癌皮下模型，经过不同方式14天的治疗后，通过测量肿瘤体积、小鼠体重和小鼠生存率等指标以及对治疗14天后的肿瘤组织进行病理切片（Hamp;E）及凋亡细胞（TUNEL）荧光染色评价DOX/HRP-DFs联合超声的体内治疗效果。③通过不同方式治疗LLC肺癌皮下模型14天后的肿瘤组织进行缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）和血小板-内皮细胞粘附分子（CD31）免疫组织化学染色以及小鼠血清HIF-1α、VEGF和CD31指标探究DOX/HRP-DFs联合超声改善肿瘤组织缺氧以及异常血管生成状况。④DOX/HRP-DFs处理C57BL/6小鼠LLC肺癌模型14天后，进行小鼠血生化检测；并对其主要器官进行病理切片染色，评价DOX/HRP-DFs的体内生物安全性。<br>　　结果<br>　　1.DOX/HRP-DFs的基本特性：①2%琼脂糖电泳验证DOX/HRP-DFs的成功合成；平均粒径为（415±9）nm，Zeta电位为（?13.3±2.2）mV；SEM和TEM观察DOX/HRP-DFs呈层状花瓣多孔样结构；DOX/HRP-DFs的主要组成元素为C、H、O、N、P。②DOX/HRP-DFs在FBS和DNaseI中均有良好的稳定性。③HRP的包载量为（50.8±1.6）μg/mL，DOX的负载率为（73.24±3.45）%；DOX/HRP-DFs在酸性环境中48h的释放量为（82.42±1.07）%，显著高于中性环境，说明DOX/HRP-DFs具有较高的载药量以及pH响应释放的特性。④DOX/HRP-DFs的催化能力明显优于游离药物且能够催化过氧化氢（H2O2）生成氧气（O2）。⑤DOX/HRP-DFs在超声辐照后能够产生大量ROS。<br>　　2.DOX/HRP-DFs联合超声对小鼠LLC细胞的抑制作用及机制：①CCK-8实验结果显示，DOX/HRP-DFs对16HBE细胞的毒性较低，但对LLC细胞活性有较强的抑制作用且在联合超声后抑制作用明显增强。②CLSM与流式细胞仪检测结果显示含有AS1411序列的DOX/HRP-DFs能够有效靶向LLC细胞并在细胞周围及外部大量聚集。③CLSM显示DOX/HRP-DFs联合超声处理过的LLC细胞内产生大量绿色荧光，流式细胞仪定量结果显示与其他组相比，超声辐照后DOX/HRP-DFs能够在细胞内产生大量ROS。④CLSM显示DOX/HRP-DFs联合超声能够引起大量LLC细胞死亡（红色荧光），流式细胞仪结果显示DOX/HRP-DFs联合超声诱导LLC细胞的凋亡率为（72.36±1.62）%。⑤CLSM显示DOX/HRP-DFs处理后的LLC细胞红色荧光强度最弱。⑥DOX/HRP-DFs联合超声处理过的LLC细胞划痕愈合率为（4.14±1.40%），显著低于其他实验组；同时DOX/HRP-DFs联合超声处理过的LLC细胞的穿膜数量也明显少于其他组，仅为（102.0±17.3）个，证明DOX/HRP-DFs联合超声能够有效抑制LLC细胞的迁移侵袭能力。<br>　　3.DOX/HRP-DFs联合超声对C57BL/6小鼠皮下LLC肺癌的治疗效果及机制：①较高浓度DOX/HRP-DFs溶液中仍未见红细胞溶血，红细胞溶血率仅为（1.41±0.08）%。②与其他治疗组相比，DOX/HRP-DFs联合超声治疗14天后的C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤体积生长明显减缓且小鼠体重无明显变化；组织病理切片显示肿瘤组织出现细胞结构改变，大量细胞核碎裂。③在治疗14天后，与其他治疗组相比，TUNEL染色显示DOX/HRP-DFs联合超声能引起大量肿瘤细胞凋亡；免疫组化结果显示，DOX/HRP-DFs联合超声治疗后的荷瘤小鼠肿瘤组织HIF-1α、VEGF和CD31表达明显降低，证明DOX/HRP-DFs能有效缓解肿瘤组织的缺氧情况并减少异常血管生成。④血生化结果显示，DOX/HRP-DFs处理过的C57BL/6小鼠心功能、肝功能和肾功能指标均在正常范围；主要器官并未出现坏死及损伤，说明DOX/HRP-DFs具有良好的体内生物安全性。<br>　　结论<br>　　本研究成功制备了主动靶向肺癌细胞的DNA纳米花（DOX/HRP-DFs），能响应肿瘤酸性微环境控释药物，缓解肺癌细胞的缺氧状况，在体内外均能显著增强化疗协同声动力疗法对肺癌的治疗效果。