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摘要目的：<br>　　慢性髓细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）是一种以髓系增生为主的造血干细胞恶性疾病，酪氨酸激酶抑制剂（ Tyrosine kinase inhibitors，TKIs）伊马替尼（Imatinib，IM）的应用使CML的病程彻底改观。然而，约有25%的患者在治疗过程中对TKIs产生不同程度的耐药问题。CML的耐药机制分为两方面：BCR-ABL依赖性耐药主要由BCR-ABL激酶结构域点突变引起，约占耐药患者的50%；BCR-ABL非依赖性耐药主要与CML细胞干性特征的维持及替代生存通路的异常激活相关，直接导致了细胞的自我更新、分化阻滞及药物外排等表现，因为耐药机制与 BCR-ABL 激酶无关，所以该种耐药很难被二代和三代 TKI 逆转。深入了解CML BCR-ABL非依赖性耐药的机制可以为临床CML的治疗提供更好的思路。本课题拟通过转录组测序分析筛选出与CML发病和耐药相关的关键基因，并进一步探究其在CML细胞伊马替尼耐药中的作用，从BCR-ABL非依赖性耐药机制的角度阐明其对CML发病及耐药的影响。<br>　　方法：<br>　　1. CDCA7L的筛选及其在CML细胞的表达和耐药中的作用。RNA转录组测序检测在慢性髓细胞白血病K562/G01（IM耐药）与K562（IM敏感）细胞中表达差异显著的基因，与GEO数据库相同细胞测序结果进行联合分析筛选出耐药相关的基因；TCGA数据库分析CDCA7L在临床CML患者与其他类型白血病患者中的表达；qRT-PCR与Western blot检测CDCA7L在K562 、K562/G01 、KCL22（IM耐药） ，急性髓细胞白血病细胞THP-1 ，急性淋巴细胞白血病细胞SupB15 的表达水平；免疫荧光实验观察CDCA7L在CML耐药细胞中的定位情况；用慢病毒载体分别构建稳定敲低以及稳定过表达CDCA7L的K562、KCL22和K562/G01细胞；CCK-8实验分别检测伊马替尼IC50值及伊马替尼处理条件下CML细胞的增殖能力；流式细胞术检测CML细胞凋亡和细胞周期；Western blot观察CDCA7L敲低后BCR-ABL的表达，同时检测伊马替尼处理条件下CDCA7L的表达情况。<br>　　2. 探究CDCA7L与CML细胞干性特征的调控关系。从转录组测序中筛选出受CDCA7L调控并且与耐药相关的基因；在敲低及过表达 CDCA7L的CML细胞株中用qRT-PCR与Western blot实验检测干性相关基因SOX2、MSI2、OCT4、NANOG和多药耐药转运蛋白P-gp的表达，克隆形成实验观察伊马替尼处理条件下细胞的自我更新及增殖能力。<br>　　3. 筛选受CDCA7L调控的关键信号通路及分子。从转录组测序和差异基因富集分析（GSEA）评估CML耐药细胞中CDCA7L与核因子-kappaB（NF-κB）信号途径的相关性；Western blot检测CDCA7L 敲低前后NF-κB信号途径关键分子IKK-β，p-IKK-β，IκB-α及 p-IκB-α在白血病细胞系中的表达；免疫荧光实验观察CDCA7L 敲低后NF-κB(p65)在K562/G01细胞内的定位与表达；CCK-8实验检测NF-κB抑制剂处理K562细胞与CDCA7L过表达的K562细胞后，细胞的伊马替尼IC50值；qRT-PCR实验检测NF-κB抑制剂处理K562/G01细胞后，多药耐药相关基因和干性相关基因的转录水平。<br>　　4. 筛选CDCA7L通过NF-κB信号途径影响CML细胞伊马替尼耐药的靶基因。信号通路富集分析联合GEO数据库筛选CDCA7L调控的靶基因；Western blot观察NLRX1在白血病细胞系的表达；qRT-PCR和Western blot检测CDCA7L敲低前后NLRX1在CML耐药细胞内的表达；RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验检测CDCA7L与NLRX1的直接互作关系；用慢病毒载体分别构建稳定敲低 NLRX1和 CDCA7L/NLRX1 双敲低的K562/GO1细胞株，CCK-8检测细胞株伊马替尼 IC50 值；qRT-PCR 实验分别检测敲低 NLRX1 及CDCA7L/NLRX1 双敲低情况下K562/G01细胞内NF-κB及干性相关基因的转录水平。<br>　　5. CDCA7L敲低结合伊马替尼（K562/G01-shCDCA7L+IM）治疗对K562/G01细胞在小鼠体内致白血病能力的影响。使用NOD-SCID免疫缺陷小鼠构建 CML 血液瘤模型。分别将 K562/G01 和K562/G01-shCDCA7L细胞尾静脉注射小鼠进行建模，间隔一周时间后注射伊马替尼进行治疗。定期监测小鼠体重、外周血白细胞数量，同时对患病死亡小鼠肝脾重量进行称量，观察白细胞在肝脾和骨髓的浸润情况。流式细胞术检测小鼠骨髓 CD45+ 细胞比例，免疫荧光和Western blot实验观察BCR-ABL蛋白在小鼠骨髓及肝脾细胞中的表达情况。记录小鼠生存期。<br>　　结果：<br>　　1. 本组RNA转录组测序和GEO数据库测序结果联合分析筛选出参与IM耐药的细胞分裂周期相关基因CDCA7L，检测CDCA7L在CML耐药细胞内特异性表达，与正常对照相比，CDCA7L在CML患者骨髓细胞内转录水平更高，并且在CML耐药细胞内显著高表达，分布于CML细胞胞核胞浆中。敲低CDCA7L后，CML耐药细胞伊马替尼IC50值明显减低，过表达CDCA7L促使CML细胞伊马替尼IC50值增高；伊马替尼抑制CML细胞恶性增殖能力，当敲低CDCA7L后， CML细胞增殖能力减弱更加明显；CDCA7L敲低显著促进CML耐药细胞的凋亡;伊马替尼处理条件下，大部分CML细胞停滞在G1期， CDCA7L过表达能加速CML细胞进入G2/S期的进程；CDCA7L敲低不影响BCR-ABL及p-BCR-ABL的表达，CDCA7L在不同浓度伊马替尼处理条件下的表达水平趋于稳定。<br>　　2. 干性相关基因（SOX2、MSI2、OCT4、NANOG）在K562/G01细胞内高表达，并且在伊马替尼处理后，出现不同程度增高现象；当敲低CDCA7L后，SOX2、MSI2、OCT4、NANOG表达水平显著降低，CML细胞自我更新和增殖能力明显减弱；过表达CDCA7L后， K562细胞干性相关基因表达水平显著上调，并在伊马替尼处理后转录水平增高，细胞克隆形成能力增强，并且削弱了伊马替尼对细胞的增殖抑制效果；多药耐药转运蛋白P-gp （ABCB1）在CML耐药细胞内特异表达，敲低CDCA7L后P-gp表达受到明显抑制。<br>　　3. 从转录组测序和GSEA 中筛选出NF-κB 信号途径；敲低CDCA7L会抑制CML耐药细胞内NF-κB信号途径的表达，使用伊马替尼处理K562/G01细胞能激活NF-κB信号通路；NF-κB信号通路在白血病细胞系内活化水平较高，敲除CDCA7L后NF-κB关键信号分子表达下调；NF-κB在K562/G01细胞内高水平表达，且分布于核质中；NF-κB抑制剂处理条件下，K562细胞与过表达CDCA7L的K562细胞伊马替尼IC50值显著降低，同时抑制了K562/G01细胞内多药耐药基因及干性相关基因的转录水平。<br>　　4. 从信号通路富集分析与GEO数据库分析的结果中发现，NOD样受体信号通路在CML耐药细胞内特异表达，其信号家族成员NLRX1是CDCA7L与NF-κB的负性调控基因；NLRX1在K562/G01细胞内的表达受到抑制，当敲低 CDCA7L 后其表达明显增高；CDCA7L与NLRX1 mRNA结合调控NLRX1的转录水平；在CDCA7L敲低的K562/G01细胞内敲低NLRX1的表达后，K562/G01细胞伊马替尼 IC50 值明显增高，同时细胞内 NF-κB 及干性相关基因（SOX2,MSI2,OCT4）的转录水平显著升高。<br>　　5. K562/G01-shCDCA7L+IM 处理明显抑制了K562/G01 细胞在小鼠体内的致白血病能力；K562/G01-shCDCA7L+IM 处理组小鼠体重、外周血白细胞数、肝脾重量及白血病细胞浸润程度、骨髓白细胞占比、CD45 阳性细胞比例、肝脾及骨髓细胞内BCR-ABL表达水平 均低于其它对照组；K562/G01-shCDCA7L+IM 处理组小鼠发病特征不明显且全部存活。<br>　　结论：<br>　　本研究首次发现 CDCA7L 及其靶基因 NLRX1 在慢性髓细胞白血病细胞中异常表达，并与慢性髓细胞白血病患者的临床发病情况、化疗药物抵抗性、干性特征以及体内致瘤能力密切相关。机制上， CDCA7L 通过与 NLRX1 mRNA 结合抑制其转录水平，诱导了NF-κB 信号途径的持续激活, 通过上调干性相关分子SOX2,OCT4,NANOG,MSI2及多药耐药转运蛋白P-gp的表达增强了CML细胞的干性特征，促使CML细胞的恶性增殖和伊马替尼耐药。综上所述，我们的研究不仅阐明了 CDCA7L 在CML伊马替尼耐药中发挥的重要作用，还揭示了 NLRX1 介导NF-κB 信号途径调控慢性髓细胞白血病细胞干性基因，从而参与耐药调控的新颖机制， CDCA7L-NLRX1-NF-κB 信号轴的发现为慢性髓细胞白血病尤其是TKIs耐药的基础研究提供了新的思路。