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摘要目的：肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, S.pn）是引起社区获得性肺炎、脑膜炎和急性中耳炎的主要原因，并且它也被认为是引起全世界高发病率和死亡率的主要细菌之一。转化，定义为外源 DNA 的摄取和同化，是抗生素耐药性在S. pn中的快速传播的重要机制。这个过程受感受态调节，感受态是一种影响约 10%链球菌基因组的生理状态。comCDE操纵子是S. pn感受态的核心调控元件，其中comC编码的感受态刺激肽(CSP)被膜转运蛋ComAB切割并输出到细胞外空间。CSP刺激膜结合组氨酸激酶ComD的自磷酸化，随后激活同源反应调节蛋白ComE。由ComE调节的基因之一comX 编码一个sigma因子，该因子激活DNA修复、DNA摄取和转化所需的基因。除了ComE之外，至今尚未有研究报道其它转录因子可直接调控S.pn的comCDE操纵子转录。本课题组前期研究发现LacI/GalR家族转录调控蛋白CcpA （SPD_1797）缺失会导致S.pn转化能力发生改变。进一步研究显示其可能与 comCDE操纵子的转录发生改变相关。本研究旨在探究转录调控因子CcpA对comCDE操纵子转录的具体调控机制。通过本研究可能发现一个调控S.pn感受态的新靶点，为细菌耐药发生和致病等方面提供有价值的实验证据。<br>　　方法：我们选择使用Janus casette（JC）作为筛选工具，对链霉素抗性D39衍生菌株(D39s)基因进行两次突变正向筛选构建ccpA无标记缺陷菌株（D39ΔccpA）。与传统的抗生素替代法相比，JC 代替法能排除由抗生素基因引入产生的极化效应。然后比较野生菌和缺陷菌的转化率，确定ccpA是否影响细菌的转化。利用质粒双交换方法构建了荧光素酶菌株，分析比较野生菌和缺陷菌comCDE启动子的转录情况。利用RNA-seq，EMSA，DNA足迹实验以及WB等方法，进一步探究CcpA调控 comCDE启动子转录的具体机制。此外，我们还比较了不同碳源条件对CcpA 介导的comCDE转录调节的影响。最后，分别通过体内与体外实验，探究 CcpA 缺陷引起的感受态改变对细菌粘附侵袭能力以及毒力的影响。<br>　　结果：在S. pn D39中，我们成功构建了ccpA的无痕缺陷菌株，并发现 ccpA 的缺失导致 S.pn 的转化效率显著降低。通过构建 CcpA 的IPTG诱导表达型菌株，确定了S. pn在表达不同浓度CcpA条件下的转化效率，发现S.pn的感受态诱导需要适宜浓度的CcpA 分子，以确保最大的转化效率。<br>　　comCDE操纵子为S.pn感受态调控的核心元件。通过构建comCDE启动子转录荧光素酶报告菌株，发现在对数生长早期野生型菌株的comCDE的转录水平显著高于ccpA缺失突变体。并通过RNA-seq进一步证实ccpA缺失后与DNA摄取相关感受态基因的表达减少，与ccpA突变体的转化率显著低于野生型的结果一致。<br>　　我们通过EMSA、DNA足迹实验以及WB等方法鉴定了在comCDE启动子区域存在4段cre（catabolite response elements, cre）结合序列，并证实除cre1外，CcpA能通过与其他3段cre序列结合后调控comCDE 的转录。与CcpA结合的cre2位于comE-box区，我们通过COIP，竞争性EMSA 以及构建ComED58E和ComED58A突变体证实了CcpA与磷酸化和去磷酸化ComE协同调控comCDE转录。<br>　　通过 RNA-seq 对 ccpA 突变株中差异表达基因进行鉴定，除了与DNA摄取相关感受态基因的表达减少之外，参与碳水化合物途径的部分基因表达上调。我们通过比较了在不同碳源条件下细菌转化的变化，发现在葡萄糖条件下的野生型和ccpA突变体的转化率都显著高于半乳糖条件下，荧光素酶结果显示comCDE启动子的转录活性变化与转化率结果一致，但野生型菌株在葡萄糖和半乳糖条件下转化的变化幅度显著高于ccpA缺陷菌株，这说明不同碳源确实影响到CcpA对转化的调控作用。通过构建HPr-S46D突变体探究Hpr蛋白对转化的影响。结果显示，HPr-S46D突变体的转化效率和comCDE转录水平显著低于野生型。当我们在 HPr-S46D 突变体中过表达 CcpA 时，其转化率和comCDE转录水平均高于HPr-S46D突变体。这表明HPr-S46D改变了CcpA介导的对PcomCDE的调控，从而影响了comCDE的转录和转化。<br>　　细胞实验显示，在感染人肺泡上皮细胞(A549细胞)期间，ccpA缺陷菌的comCDE转录水平仍显著低于野生型，且ccpA突变能减少S.pn对肺上皮细胞 A549 的黏附作用。在小鼠感染模型中，ccpA 突变株在小鼠鼻腔定植和肺部侵袭能力显著降低，在败血症模型中表现出生存率的显著增高。提示CcpA对感受态的调控作用对S.pn D39在体内感染和适应也很重要。<br>　　结论：本研究发现了一个新的可直接调控 comCDE 操纵子转录的蛋白—分解代谢物控制蛋白A（CcpA）。我们证实CcpA与comCDE启动子区域的 cre序列结合后以最适浓度的方式调控S.pn转化，并与磷酸化和去磷酸化ComE协同作用综合调控PcomCDE的转录，维持S.pn最佳感受态发展。CcpA还能通过感受不同碳源信号调控comCDE的转录。不同碳源既能通过直接影响CcpA对comCDE的转录调控，也能通过调节P-Ser-HPr的合成影响CcpA对comCDE的转录调控。此外，与 D39s 相比，ΔccpA 突变体的鼻咽定植减少，对小鼠的毒力作用减弱。这些结果表明，碳代谢主调节因子CcpA通过调控comCDE的转录来调节感受态的发生和转化能力，并且这一过程也会影响S.pn在宿主体内适应和定植。