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摘要研究背景：人和小鼠体内的白色脂肪组织以甘油三酯的形式储存能量，并通过分泌脂肪因子等方式影响全身的代谢水平。在冷刺激、运动等情况下白色脂肪组织内产热相关基因的表达水平上调，向“米色化”转化，将甘油三酯以热量的形式转化，研究白色脂肪组织米色化可为治疗肥胖及相关代谢性疾病提供有效的治疗方法。白色脂肪米色化并发挥产热功能的主要效应分子为解偶联蛋白1（UncouplingProtein1，UCP1），如何调控UCP1的表达水平及活性是研究白色脂肪米色化、细胞产热的重要研究内容。我们在前期研究中发现急性冷暴露早期小鼠的皮下白色脂肪组织中UCP1仅蛋白水平明显上调，提示我们UCP1可能存在着尚未发现的某种翻译后修饰调控机制。<br>　　线粒体泛素连接酶1（MitochondrialE3UbiquitinProteinLigase1，MUL1）是一种E3泛素连接酶，是位于线粒体外膜上的两次跨膜蛋白。有研究证实MUL1可以通过促线粒体蛋白泛素化水平调控线粒体的自噬、裂变等过程影响细胞代谢，其底物研究较局限，主要为线粒体相关蛋白，例如动力蛋白相关蛋白1（Dynamin-relatedProtein1,DRP1）、线粒体融合蛋白2（Mitofusin2，MFN2）。除此之外，MUL1是否在肥胖等代谢相关的疾病过程中起作用，以及其在不同组织中的调控底物和机制是否有所不同，我们知之甚少。<br>　　目的和意义：该研究旨在探究急性冷暴露前期是否存在UCP1的翻译后修饰调控，揭示调控其翻译后修饰的上游机制，为治疗肥胖及相关代谢性疾病提供潜在的治疗靶点。<br>　　方法：（1）以c57小鼠为研究对象，构建急性冷暴露（0、15分钟、30分钟、4小时）模型，利用qPCR、WB方法检测皮下白色脂肪组织、棕色脂肪组织中产热相关基因的转录水平变化以及UCP1的蛋白水平变化。（2）在动物模型、原代细胞中，通过WB方法检测cAMP-PKA信号通路的激活水平和UCP1的蛋白水平（3）在细胞水平，通过转染质粒、Ni-NTApulldown等分子生物学技术检测UCP1的泛素化特征。（4）以动物模型小鼠为研究对象，通过免疫共沉淀、WB检测皮下白色脂肪组中UCP1的泛素化水平变化。（5）在细胞水平，通过检测分别转染候选E3泛素连接酶后UCP1的蛋白水平。（6）在细胞水平，通过免疫共沉淀、WB等方式检测MUL1与UCP1的相互作用及转染MUL1后UCP1的泛素化水平变化。（7）以体外培养并诱导成脂的小鼠原代脂肪血管基质细胞为研究对象，通过qPCR、WB检测细胞感染腺病毒过表达或敲低MUL1表达后UCP1的转录和蛋白水平变化。（8）以野生型和UCP1敲除小鼠为研究对象，通过肛温测量仪检测皮下白色脂肪组织定点注射腺病毒过表达或敲低MUL1表达的小鼠冷暴露过程中核心体温变化。（9）以体外培养并诱导成脂的小鼠（野生型和UCP1敲除小鼠)原代脂肪血管基质细胞为研究对象，利用seahorse检测细胞感染腺病毒过表达或敲低MUL1表达后线粒体的能量代谢水平变化。<br>　　结果：（1）小鼠棕色脂肪组织中，冷暴露后4小时时间点UCP1的转录水平明显上调，冷暴露0-4小时UCP1的蛋白水平无明显变化；小鼠皮下白色脂肪组织中，冷暴露后4小时时间点UCP1的转录水平明显上调，冷暴露后后15、30分钟时UCP1的蛋白水平明显上调。（2）急性冷暴露早期诱导小鼠白色脂肪组织中UCP1蛋白水平的上调时cAMP-PKA信号通路无明显激活。（3）UCP1的K67R可发生泛素化，经溶酶体途径降解。（4）急性冷暴露后小鼠皮下白色脂肪组织中UCP1蛋白的泛素化水平随着暴露时间的延长而下降。（5）在候选的E3泛素连接酶中，MUL1可与UCP1相互作用并特异性调控UCP1泛素化水平上调，蛋白水平下调。（6）在诱导成脂的小鼠原代svf细胞内敲低MUL1表达后，UCP1的转录水平无明显差异，蛋白水平上调，蛋白稳定性增加；过表达MUL1后，UCP1的转录水平无明显差异，蛋白水平下调，蛋白稳定性降低。（7）在野生型小鼠中，皮下白色脂肪组织中敲低MUL1的表达小鼠急性冷暴露后核心体温较对照组高；过表达MUL1的小鼠急性冷暴露后核心体温较对照组低。（8）在Ucp1敲除小鼠中，皮下白色脂肪组织中过表达或敲低MUL1表达，急性冷暴露后核心体温与对照组无明显差异。（9）在诱导成脂的野生型小鼠原代svf细胞内，敲低MUL1表达会上调细胞的基础耗氧量和、最大耗氧能力；过表达MUL1会下调细胞的基础耗氧量和最大耗氧能力。（10）在诱导成脂的Ucp1敲除小鼠原代svf细胞中敲低或过表达MUL1细胞的线粒体功能无明显差异。<br>　　结论：（1）急性冷暴露后小鼠皮下白色脂肪组织中UCP1以非转录调控的蛋白水平上调为主要变化，且此过程不依赖于cAMP-PKA信号通路的激活。（2）急性冷暴露后小鼠皮下白色脂肪组织中UCP1蛋白的泛素化水平下调可能是其蛋白水平上调的直接原因。（3）经筛选并验证发现具有线粒体定位的E3泛素连接酶MUL1可以与UCP1相互作用，且促进UCP1的泛素化水平，以非转录调控的方式调控UCP1的蛋白稳定性，可能参与了急性冷暴露早期UCP1蛋白水平上调的调控机制；（4）MUL1可以通过调控UCP1的蛋白稳定性介导小鼠的适应性产热及细胞内的线粒体能量代谢。