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摘要下呼吸道感染是全球第四大死因，每年导致 200 多万人死亡。细菌性肺炎作为下呼吸道感染的最常见形式，是一种致命性急性肺实质感染。近年来，抗菌药物的大量广泛应用对细菌进化造成的选择性压力加速了细菌获得耐药性的速度，甚至细菌获得耐药性的速度已经远远超过了新型抗菌药物的研发速度，这使得细菌性肺炎的临床抗感染治疗仍面临巨大困境，临床患者的死亡率仍居高不下。通过靶向宿主免疫调节，可有效避免微生物耐药性进化的选择压力。因此，从免疫调节角度探索细菌性肺炎的致病机制对细菌性肺炎治疗新策略的提出至关重要。近期我们发现一个新型免疫调节因子-- Prokineticin 2 （PK2）在细菌性肺炎中发挥重要的免疫保护作用，具体机制尚不清楚。<br>　　目的:<br>　　本研究旨在通过评价 PK2 作为细菌性肺炎诊断标志物的潜在价值，并阐明PK2在细菌性肺炎中的免疫调节作用及作用机制，为细菌性肺炎的临床诊疗提供新思路。<br>　　方法:<br>　　从重庆医科大学附属第二医院和重庆医科大学附属儿童医院收集肺炎及重症肺炎患者入院当天的外周血血清样本，健康志愿者的外周血血清样本作为对照，ELISA 法检测样本中的 PK2 水平，ROC 曲线分析 PK2的诊断价值；并进一步通过非参数 Spearman 秩相关系数探讨PK2与肺炎疾病严重程度之间的相关性。然后通过铜绿假单胞菌（P.a）支气管给药建立细菌性肺炎小鼠模型，并通过Western Blot及免疫荧光实验验证PK2在肺炎中表达量的改变。然后，利用生存率实验、肺组织病理分析、伊文思蓝实验、TUNEL 实验、细菌载量测定及支气管肺泡灌洗液中 LDH、总蛋白水平的检测等明确重组鼠 PK2蛋白（rmPK2）在细菌性肺炎中的免疫调节作用（同时初步探索 PK2在病毒性肺炎中的免疫调节作用）；通过检测肺部常见炎症因子及趋化因子水平判断PK2对肺部炎症的影响。利用流式细胞术（FCM）检测支气管肺泡灌洗液中各白细胞（WBC）亚型的数目及比例变化，明确 PK2对 WBC趋化的影响，并利用划痕实验、transwell实验进行进一步验证。接下来分离培养 PK2 作用的原代靶细胞，设 rmPK2 处理组和对照组，通过体外的吞噬实验（荧光法）及杀伤实验（菌落计数法）以及 NO生成、相对 NOS活性的检测探索 PK2对免疫细胞抗感染能力的影响；通过蛋白质组学分析对潜在机制进行筛选和预测，通过 Western Blot实验探索 PK2对其胞内信号通路的调控机制。同时，体内通过免疫细胞耗竭实验对该效应细胞进行验证。<br>　　结果:<br>　　1．肺炎患者外周血中 PK2 水平显著降低且降低幅度与肺炎严重程度相关<br>　　1）经 ELISA 检测儿童及成人肺炎患者、健康志愿者外周血血清PK2 水平，结果显示与健康对照组相比，成人及儿童肺炎患者血清中PK2 浓度均显著降低，且同组内的肺炎患者和健康对照组的血清 PK2水平在不同性别和年龄之间没有显著差异。<br>　　2）进一步结合临床数据进行分析发现，重症肺炎患者的血清PK2水平显著低于非重症肺炎患者，机械通气患者的血清PK2水平显著低于非机械通气患者。并且血清PK2水平还与APACHEⅡ评分、肺炎严重程度指数评分、住院天数、PCT水平呈显著负相关。<br>　　3 ） ROC 曲线分析结果显示成人和儿童的 ROC 曲线下面积（AUC）分别为0.8337和0.8603。<br>　　2．细菌性肺炎小鼠肺部PK2水平较对照组显著降低<br>　　P.a 气管内给药建立细菌性肺炎小鼠模型，收集肺组织并通过Western Blot 实验及免疫荧光实验检测 PK2 水平，结果显示，细菌性肺炎小鼠肺中PK2水平与对照组相比显著降低，与临床结果相吻合。3．PK2在细菌性肺炎中发挥保护作用。<br>　　1）通过生存率试验发现，rmPK2 处理组小鼠较对照组小鼠生存率更高，且呈剂量依赖性。通过rmPK2的不同给药方式及不同给药时间的生存率试验发现，静脉注射、气管内注射和腹腔注射rmPK2均能有效提高细菌性肺炎小鼠的生存率，三者之间无显著差异；建模的同时给予rmPK2处理的小鼠比建模后24小时、48小时给予rmPK2处理的小鼠具有更高的生存率，且越早给予rmPK2处理，细菌性肺炎小鼠的生存率越高。<br>　　2）建模后24h和48h取小鼠肺组织进行HE染色，镜检分析发现，对照组小鼠肺组织中肺泡壁增厚，大量肺泡结构破坏、融合，肺泡间隔出血严重，rmPK2 处理组小鼠肺组织肺泡结构相对完整，出血较少。并且，rmPK2 处理组小鼠支气管肺泡灌洗液中 LDH 水平显著降低。<br>　　TUNEL 实验显示 rmPK2 处理组小鼠肺组织细胞凋亡较对照组显著减轻。<br>　　3）伊文思蓝实验显示 rmPK2 处理组小鼠与对照组相比，肺组织染料含量显著减少。并且rmPK2处理后小鼠支气管肺泡灌洗液中红细胞量及总蛋白渗出水平显著降低。<br>　　4）肺部细菌载量检测结果表明，在感染早期，rmPK2 处理组小鼠肺部菌载量显著低于对照组小鼠。<br>　　5）建立革兰阳性菌性肺炎模型发现，rmPK2 处理后肺炎小鼠死亡率及肺部细菌载量显著降低；但在病毒性肺炎时，rmPK2 处理组与对照组相比，生存率、体重变化曲线、病毒载量均无显著差异。<br>　　4. PK2在细菌性肺炎中对肺部炎症反应无显著影响<br>　　收集肺匀浆进行 ELISA 实验表明 rmPK2 处理组与对照组相比，肺部常见细胞因子（ IL-6、IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-17A 和 IL-27）和趋化因子（CXCL1 和 CCL2）的表达水平无显著差异。<br>　　5.细菌性肺炎中PK2诱导巨噬细胞趋化<br>　　1）FCM检测BALF中各白细胞比例及数目，结果表明rmPK2处理组小鼠 BALF 中的巨噬细胞比例及数目显著高于对照组，而中性粒细胞比例及数目在两组间无显著差异，免疫荧光实验结果也表明rmPK2处理后小鼠肺部巨噬细胞浸润增多。<br>　　2）体外细胞划痕实验显示 rmPK2 处理组迁移后划痕宽度明显窄于对照组；transwell实验表明rmPK2处理后迁移至下室的细胞量显著增多。<br>　　6. PK2增强巨噬细胞对细菌的吞噬和杀伤作用<br>　　体外吞噬实验及杀伤实验结果显示rmPK2预处理后巨噬细胞对对FITC荧光标记的铜绿假单胞菌的吞噬及对胞内铜绿假单胞菌的杀伤能力显著增强。此外，rmPK2 预处理显著增强了细菌感染时巨噬细胞的NO生成能力和相对NOS活性。但对于中性粒细胞，rmPK2预处理组与对照组相比，摄取的 FITC 荧光标记的铜绿假单胞菌及对铜绿假单胞菌的杀伤率均无显著差异。<br>　　7. PK2在细菌性肺炎中的保护效应依赖于巨噬细胞<br>　　巨噬细胞耗竭实验显示，与对照组相比，巨噬细胞耗竭后 rmPK2的保护作用显著减弱，表现为 P.a+Clodronate-Liposomes+rmPK2 组小鼠生存率较 P.a+PBS-Liposomes+rmPK2 组显著降低，P.a+Clodronate-Liposomes+rmPK2组小鼠肺部细菌载量较 P.a+PBS-Liposomes+rmPK2组显著增加。<br>　　8. PK2通过调节下游ERK1/2活化增强巨噬细胞吞噬杀伤功能<br>　　1）KEGG 通路富集分析显示 rmPK2 处理组与对照组巨噬细胞中的差异表达蛋白在 MAPK信号通路显著富集，Western Blot实验表明rmPK2 处理组巨噬细胞 ERK1/2 的磷酸化水平与对照组相比显著增强。<br>　　2）使用抑制剂抑制ERK1/2的活化后，PK2对巨噬细胞吞噬杀伤的增强效应减弱，表现为 rmPK2 与 ERK1/2 抑制剂协同处理组与仅rmPK2 处理组相比，摄取的 FITC 荧光标记的铜绿假单胞菌及对铜绿假单胞菌的杀伤率均显著降低。<br>　　结论:<br>　　肺炎患者血清中降低的 PK2 水平与疾病严重程度相关，提示PK2 可作为肺炎辅助诊断和预后评估的潜在标志物。PK2 通过调控巨噬细胞的趋化和功能增强宿主对细菌的清除能力，从而在细菌性肺炎中发挥保护效应。因此，本研究对细菌性肺炎的免疫治疗具有潜在的指导意义。