NPM1突变蛋白介导lncRNA HOTAIRM1高表达下调EGR1促进白血病细胞存活-论文-万方医学网

NPM1突变蛋白介导lncRNA HOTAIRM1高表达下调EGR1促进白血病细胞存活

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摘要背景：急性髓系白血病（AML）伴核仁磷酸蛋白（NPM1）基因突变是新近独立的白血病亚型，具有独特的长链非编码RNA（lncRNA）表达谱。然而，目前对lncRNA在NPM1突变白血病中的作用知之甚少。本文旨在探讨lncRNAHOX反义基因间RNA髓系1（HOTAIRM1）在NPM1突变白血病中的生物学功能及其分子机制。 　　方法： 　　(1)利用生物信息学分析方法，从GEO、TCGA数据库中筛选NPM1突变白血病细胞中差异表达的lncRNAs；qRT-PCR检测白血病细胞株和临床样本中HOTAIRM1的表达量；荧光原位杂交（FISH）实验观察HOTAIRM1在白血病细胞的定位情况；Kaplan-Meier生存分析评估HOTAIRM1在白血病中的临床预后价值。 　　(2)利用慢病毒或过表达质粒转染于白血病细胞中干扰或过表达NPM1突变蛋白（NPM1-mA），westernblot验证干扰或过表达效率；qRT-PCR观察NPM1-mA对HOTAIRM1表达水平的影响；采用荧光素酶报告实验和染色质免疫共沉淀（CHIP）实验验证NPM1-mA对KLF5介导HOTAIRM1转录调控的作用；慢病毒干扰联合蛋白合成抑制剂CHX、蛋白酶体抑制剂MG132处理白血病细胞，免疫共沉淀（Co-IP）实验观察NPM1-mA对KLF5蛋白稳定性的调控。 　　(3)慢病毒干扰、质粒过表达技术处理白血病细胞，结合westernblot、IF、CCK8和FCM实验观察HOTAIRM1对白血病细胞自噬、增殖、周期和凋亡表型的影响。 　　(4)根据RNApulldown质谱鉴定分析结果筛选HOTAIRM1潜在的互作蛋白；RNApulldown和RIP实验双向验证HOTAIRM1与目标蛋白EGR1的相互作用。qRT-PCR和westernblot检测HOTAIRM1对EGR1表达的影响；慢病毒干扰或过表达技术联合CHX/MG132抑制剂处理白血病细胞、结合westernblot观察HOTAIRM1对EGR1蛋白稳定性的调控作用；利用UbiBrowser数据库预测可能修饰EGR1泛素化的E3泛素连接酶；泛素化实验观察MDM2对EGR1的泛素化修饰；RNApulldown联合westernblot检测HOTAIRM1与EGR1、MDM2之间的相互作用；Co-IP实验观察HOTAIRM1与MDM2/EGR1复合物之间的关系。 　　(5)利用westernblot、CCK8和FCM实验观察EGR1过表达对白血病细胞自噬、增殖、周期和凋亡的影响；通过回复实验进一步观察EGR1在HOTAIRM1调控白血病细胞恶性表型中的重要作用。 　　(6)将人源白血病OCI-AML3细胞（shHOTAIRM1、shHOTAIRM1+HOTAIRM1）经尾静脉注入NOD/SCID小鼠以构建白血病动物模型，生存曲线分析小鼠总生存时间；瑞氏染色后在显微镜下进行小鼠骨髓象分析；苏木精-伊红（HE）染色观察肝脾组织中白血病细胞的浸润情况；通过免疫组织化学（IHC）染色检测Ki67增殖抗原观察白血病细胞增殖情况；westernblot检测自噬关键分子LC3和p62观察小鼠体内白血病细胞自噬活性。 　　结果： 　　(1)基于生信分析发现大样本数据库中NPM1突变AML患者高表达HOTAIRM1；在NPM1突变AML细胞系OCI-AML3和临床白血病原始细胞中证实HOTAIRM1高表达，并定位在白血病细胞胞质和胞核两部分；HOTAIRM1高表达与临床预后不良密切相关。 　　(2)干扰NPM1-mA可抑制白血病细胞HOTAIRM1表达，而过表达NPM1-mA则促进HOTAIRM1表达；敲低NPM1-mA后KLF5与HOTAIRM1启动子结合减弱、HOTAIRM1荧光素酶活性降低；同时，干扰NPM1-mA可促进WWP1对KLF5的泛素化修饰，进而抑制KLF5对HOTAIRM1表达的转录调控。 　　(3)敲低HOTAIRM1可抑制白血病细胞自噬活性、增殖能力、细胞周期进程，并促进细胞凋亡；过表达HOTAIRM1则观察到相反的生物学效应。 　　(4)分析质谱结果筛选出与HOTAIRM1潜在结合的互作蛋白EGR1，生物信息学预测HOTAIRM1上存在2个与EGR1结合的潜在位点，RNApulldown和RIP实验进一步证实HOTAIRM1上Site2位点与EGR1特异性结合；HOTAIRM1抑制EGR1蛋白表达而不影响其mRNA表达；MDM2作为E3泛素连接酶介导EGR1蛋白的泛素化修饰；HOTAIRM1作为支架分子增强MDM2和EGR1相互作用、促进MDM2对EGR1的泛素化修饰，导致EGR1蛋白水平下调。 　　(5)过表达EGR1抑制白血病细胞自噬、增殖和周期进程，促进细胞凋亡；回复实验结果进一步表明EGR1在HOTAIRM1促进白血病细胞存活中的重要作用。 　　(6)shHOTAIRM1组小鼠生存时间显著缩短、骨髓、肝脾等造血组织中白血病细胞浸润减少、Ki67标记的阳性细胞数量明显减少、自噬分子LC3表达下调而p62表达上调，在shHOTAIRM1后过表达HOTAIRM1则能逆转上述效应。 　　结论： 　　(1)HOTAIRM1在NPM1突变白血病中高表达，并定位于白血病细胞胞质和胞核两部分。 　　(2)NPM1突变蛋白抑制WWP1介导的KLF5泛素化降解，KLF5发挥对HOTAIRM1表达的转录调控作用，从而促进HOTAIRM1表达。 　　(3)HOTAIRM1促进白血病细胞自噬、增殖和周期进程，抑制细胞凋亡，发挥促癌作用。 　　(4)HOTAIRM1与胞核蛋白EGR1特异性结合，并作为支架分子促进MDM2对EGR1的泛素化降解过程。 　　(5)HOTAIRM1通过EGR1促进白血病细胞体外存活。 　　(6)HOTAIRM1促进小鼠体内白血病的发生发展。