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摘要目的：脓毒症是一种以全身性过度炎症和危及生命的器官功能障碍为特征的严重疾病。在脓毒症期间，肝脏具有重要的作用，如免疫防御和对炎症的代谢适应，而肝功能障碍通常与患者的不良预后密切相关。CD36作为B类清道夫受体的一员，已被报道在动脉粥样硬化和脂肪肝等多种疾病中发挥着重要作用。然而，肝细胞CD36在脓毒症肝损伤中的作用及其作为临床治疗靶点的潜力尚未被探索。因此，本研究旨在探究肝细胞CD36在脓毒症肝损伤中的作用及具体分子机制。<br>　　方法：第一部分：（1）收集对照和脓毒症患者肝脏样本，Hamp;E染色观察肝脏炎症细胞浸润，免疫荧光共染观察 CD36 在肝细胞中的定位；（2）C57BL/6J小鼠腹腔注射12 mg/kg的脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）以构建脓毒症小鼠模型，Hamp;E染色观察肝脏炎症细胞浸润，血清学检测谷丙转氨酶（Glutamic pyruvic transaminase，GPT/ALT）和谷草转氨酶（Glutamic oxaloacetic transaminase 1，GOT1/AST）水平，免疫荧光共染观察CD36在肝细胞中的定位；<br>　　第二部分：（1）分别构建CD36过表达（Overexpression，OE）和敲除（Knockout，KO）的细胞并给予LPS处理，免疫印迹检测凋亡标记物和自噬相关蛋白的表达水平，转导mRFP-GFP-LC3腺病毒后通过共聚焦显微镜观察并计算红色和黄色荧光点数量，免疫荧光共染观察LAMP1和LC3的共定位，LysoSensor染色检测溶酶体pH，透射电镜观察自噬溶酶体；（2）构建两种CD36 KO细胞，并在KO细胞上回补CD36表达，给予细胞LPS和/或CQ处理后，免疫印迹检测自噬相关蛋白的表达水平，LC3免疫荧光观察自噬体，转导mRFP-GFP-LC3腺病毒后通过共聚焦显微镜观察并计算红色和黄色荧光点数量。<br>　　第三部分：（1）给予CD36 OE和CD36 KO的细胞LPS处理，免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）检测融合相关的可溶性 N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（ Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE）复合物的形成（即突触融合蛋白 17 （ Syntaxin 17 ， STX17 ），突触体相关蛋白 29 （ Synaptosome associated protein 29，SNAP29）和囊泡相关膜蛋白8（ Vesicle associated membrane protein 8，VAMP8）组成的复合体），免疫印迹检测STX17，SNAP29和VAMP8蛋白表达，qPCR检测STX17， SNAP29和VAMP8的mRNA水平，蛋白酶体抑制剂MG132处理后免疫印迹检测 SNAP29 和 VAMP8 蛋白表达，蛋白合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide，CHX）处理后免疫印迹检测SNAP29和VAMP8蛋白表达，Co-IP检测CD36 OE和CD36 KO细胞SNAP29和VAMP8的泛素化水平；<br>　　第四部分：（1）给予或不给予CD36 OE细胞LPS处理，Co-IP检测CD36与UBQLN1，SNAP29和VAMP8的共结合，免疫沉淀和酰基-生物素交换法（Immunoprecipitation and acyl-biotin exchange，IP-ABE）检测CD36棕榈酰化水平；（2）给予CD36 OE细胞LPS和/或ML348 （ CD36 去棕榈酰化酶抑制剂）处理，共聚焦显微镜观察 CD36 与Na+/K+-ATP酶1（ATPase Na+/K+transporting subunit alpha 1，ATP1A1，质膜标志物）的共定位；（3）构建表达 CD36 野生型（WT-CD36）或CD36 棕榈酰化位点突变（CD36 AA-SS）的细胞，共聚焦显微镜分别观察 CD36 与 ATP1A1、RAB5、LAMP1 及 LC3 的共定位，Co-IP 检测CD36 与 UBQLN1 ， SNAP29 和 VAMP8 的共结合，免疫印迹检测SNAP29和VAMP8蛋白表达。<br>　　结果：第一部分：（1）与各自对照肝脏组织相比，脓毒症患者和LPS诱导的脓毒症小鼠肝脏组织都表现出炎性细胞浸润增加和肝细胞CD36表达增加；（2）LPS（HepG2细胞处理浓度为10μg/mL，L02细胞处理浓度为3μg/mL）处理24 h诱导细胞CD36，LC3-II和SQSTM1表达增加，并且CQ处理不能进一步增加LC3-II和SQSTM1的蛋白水平，提示LPS诱导肝细胞发生自噬晚期阻滞；<br>　　第二部分：（1）CD36 KO下调SQSTM1和cleaved-CASP3的蛋白表达并上调LC3-II蛋白表达，而CD36 OE上调LC3-II，SQSTM1和cleaved-CASP3的蛋白表达；转导mRFP-GFP-LC3腺病毒后发现，CD36 KO 增加了红色斑点数量并减少了黄色斑点数量，CD36 OE 减少了红色斑点数量并增加了黄色斑点数量；CD36 KO促进LAMP1和LC3的共定位，CD36 OE减少LAMP1和LC3的共定位，而无论是CD36 KO或OE都不会影响溶酶体酸性环境；透射电镜结果显示CD36 KO增加了细胞中自噬溶酶体数量，而CD36 OE减少了自噬溶酶体数量，上述结果提示CD36负性调控自噬体-溶酶体融合；（2）CQ处理会增加两种CD36 KO细胞中LC3-II和SQSTM1的蛋白水平，但CQ处理不会改变回补CD36表达细胞中LC3-II和SQSTM1的蛋白水平；与CD36 KO细胞相比，回补CD36表达的细胞中LC3阳性荧光点的数量显著增加，转染mRFP-GFP腺病毒后，回补细胞中红色荧光点（自噬溶酶体）数量减少，黄色荧光点（自噬体）数量增加。这些结果进一步证实CD36在调控自噬体-溶酶体融合过程中的关键作用。<br>　　第三部分：（1）Co-IP结果显示，CD36 KO增加了自噬SNARE复合体（STX17-SNAP29-VAMP8）形成，CD36 OE减少了自噬SNARE复合体的形成；CD36 KO或OE不影响STX17，SNAP29和VAMP8的mRNA表达；CD36 KO可以上调SNAP29和VAMP8的蛋白表达，LPS处理或CD36 OE下调SNAP29和VAMP8的蛋白表达；MG132处理后，CD36 OE细胞与对照细胞之间SNAP29和VAMP8蛋白表达没有显著差异，提示CD36可能通过转录后机制来调控SNAP29和VAMP8蛋白；（2）与各自的对照细胞相比，CD36 KO促进了SNAP29和VAMP8的蛋白稳定性并降低SNAP29和VAMP8的泛素化水平，而CD36 OE降低了SNAP29和VAMP8的蛋白稳定性并增加SNAP29和VAMP8的泛素化水平，提示CD36调控SNAP29和VAMP8蛋白的泛素-蛋白酶体降解；<br>　　第四部分（：1）LPS显著促进CD36与UBQLN1，SNAP29和VAMP8之间的相互作用；LPS降低CD36棕榈酰化水平，并显著减少CD36在细胞质膜上的分布，而ML348可以使LPS处理细胞中的CD36重新分布至细胞质膜上；与表达WT-CD36的细胞相比，表达CD36AA-SS的细胞中CD36在质膜上的定位减少，提示：CD36的去棕榈酰化是LPS介导的CD36内化所必需的；（2）与没有LPS处理的细胞相比，LPS处理的细胞中 CD36 与 RAB5 和 LAMP1 的共定位率显著增加；在没有LPS处理的情况下，与表达WT-CD36的细胞相比，表达CD36AA-SS的细胞中CD36与RAB5和LAMP1的共定位率显著增加；此外，无论有无LPS的处理，我们都几乎没有观察到CD36在自噬体上的共定位，表明：LPS可能通过促进CD36去棕榈酰化修饰介导CD36定位至内体/溶酶体上；（3）与表达WT-CD36的细胞相比，表达CD36AA-SS的细胞中 CD36 与 UBQLN1，SNAP29 和 VAMP8 的结合增加，SNAP29 和VAMP8 的蛋白水平下调，表明：CD36 去棕榈酰化修饰对于 CD36-UBQLN1-SNARE 复合体形成及 SNARE 蛋白的泛素-蛋白酶体降解至关重要。<br>　　结论：脓毒症时，肝细胞CD36发生去棕榈酰化修饰并从质膜转移到溶酶体上，随后CD36招募UBQLN1并以依赖UBQLN1的方式促进融合相关 SNARE 蛋白（SNAP29 和 VAMP8）的泛素-蛋白酶体降解，从而减少 SNARE 蛋白复合体形成，导致自噬体-溶酶体融合障碍和脓毒症肝损伤。抑制肝细胞 CD36 表达或靶向其在肝细胞中的棕榈酰化可能为脓毒症肝损伤治疗提供新靶点和新思路。