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摘要目的：气管损伤是一类由微生物感染（如气管支气管结核）、物理性损伤（如气管切开、气管插管、支架置入）等造成的致命性气道疾病。气管损伤后异常修复引起气管进行性狭窄，甚至完全闭塞，严重损害患者生命健康。患者因症就诊时常已达病程晚期，治疗十分棘手。目前除气道介入清理及手术切除狭窄组织外，尚无有效缓解气管损伤及气管狭窄的治疗药物和方法。因此，深入探索气管损伤修复分子机制，对于开发气管损伤及狭窄新型分子靶向药物、制定新的治疗策略有重要实际意义。转录因子GATA结合蛋白6（GATA-binding protein6,GATA6）通过调控核因子-κB（Nuclear factor-κB,NF-κB）通路及靶基因转录，参与组织炎症、器官纤维化及肿瘤性疾病发生发展。NF-κB通路激活可上调NOD样受体家族Pyrin结构域蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain containing protein3,NLRP3）表达，进而促进NLRP3炎症小体活化，与多种组织损伤修复密切相关。然而，GATA6是否通过调控NLRP3炎症小体影响气管损伤修复尚无研究报道。本研究旨在探讨GATA6及NLRP3炎症小体对气管损伤修复的作用和分子机制，以期为气管损伤及气管狭窄无创诊断和精准治疗提供有效靶点。<br>　　方法：人群及动物模型研究：纳入气管支气管结核后瘢痕狭窄支架置入患者及健康对照患者，检测人气管组织和血清GATA6、NLRP3炎症小体和纤维化水平，分析其相关关系及诊断效能。建立大鼠气管损伤修复模型，苏木精amp;伊红染色法观察气管狭窄程度，马松染色、实时荧光定量聚合酶链反应、免疫印迹（Western blot）、免疫组化及免疫荧光染色检测GATA6表达、NLRP3炎症小体及纤维化情况。<br>　　体外研究：（1）上皮细胞：采用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）及NLRP3激动剂尼日利亚菌素（Nigericin）刺激，构建气管上皮细胞（BEAS-2B和RTE）损伤模型，检测GATA6、NLRP3炎症小体及焦亡情况。敲低或过表达GATA6，并予NF-κB抑制剂（Bay-117082）处理，结合转录组测序分析GATA6干预后差异表达基因及功能，采用酶联免疫吸附测定、乳酸脱氢酶释放实验、PI/Hoechst33258染色、Western blot及免疫荧光染色检测细胞损伤后NF-κB通路、NLRP3炎症小体活化及焦亡水平。运用染色质免疫共沉淀技术及双荧光素酶报告实验，探讨GATA6对NLRP3启动子的靶向调控关系。<br>　　（2）共培养模型：予BEAS-2B和RTE细胞过表达GATA6，同时抑制NLRP3，利用免疫荧光、Western blot检测上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transformation,EMT）情况。构建大鼠气管上皮细胞-成纤维细胞共培养体系，予LPS、Nigericin及NLRP3抑制剂（MCC950）刺激，同时敲低或过表达上皮细胞GATA6水平，Western blot检测成纤维细胞合成分泌细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）情况。<br>　　（3）成纤维细胞：提取原代大鼠气管成纤维细胞（Rat tracheal fibroblast,RTF）和人气管肉芽成纤维细胞（Human tracheal granulation fibroblast,HTGF），予转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）处理，并敲低或过表达细胞GATA6水平，运用Western blot、实时荧光定量聚合酶链反应和免疫荧光染色检测GATA6表达及ECM分泌情况，采用5-乙炔基-2''-脱氧尿苷染色及CCK8方法分析细胞增殖水平，利用流式细胞术及Western blot检测细胞凋亡。<br>　　体内研究：通过气管内注射慢病毒下调大鼠气管GATA6表达，并构建气管损伤修复模型，采用酶联免疫吸附测定、苏木精amp;伊红染色、马松染色、实时荧光定量聚合酶链反应、Western blot、免疫组化及免疫荧光染色检测大鼠气管组织及血清GATA6、NLRP3炎症小体活化、细胞焦亡和纤维化水平。<br>　　结果：人群及动物模型研究：（1）与健康人群相比，气管损伤患者血清GATA6、NLRP3炎症小体、白细胞介素（Interleukin,IL）-1β及IL-18水平显著升高，且GATA6与NLRP3炎症小体、IL-1β及IL-18浓度呈正相关关系，可能作为鉴别诊断气管损伤的理想标志物。与正常对照气管和瘢痕组织相比，气管损伤患者气管肉芽组织GATA6、NLRP3和平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达增加。（2）大鼠气管损伤导致气管粘膜肉芽组织明显增生，GATA6和I型胶原α1（collagen1a1）、纤连蛋白（fibronectin）、α-SMA及TGF-β1等纤维化标志物水平逐渐升高，NLRP3、天冬氨酸蛋白水解酶-1（Cysteinyl aspartate-specific proteases-1,caspase-1）、IL-1β及IL-18等NLRP3炎症小体活化标志物在损伤后第2天和第8天显著增加。（3）GATA6主要定位于人及大鼠气管肉芽组织上皮细胞和成纤维细胞。<br>　　体外研究（：1）上皮细胞：LPS可促进BEAS-2B和RTE细胞GATA6及NLRP3表达。LPS联合Nigericin处理可导致NLRP3炎症小体激活，并引发上皮细胞焦亡。敲低GATA6能抑制LPS诱导的NLRP3激活、减少LPS+Nigericin诱导的NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡。过表达GATA6可激活气管上皮细胞NF-κB/NLRP3信号通路，同时GATA6直接结合NLRP3启动子区域，与NF-κB协同上调NLRP3启动子活性，进而促进NLRP3表达增加。<br>　　（2）共培养模型：过表达GATA6导致气管上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）水平降低、α-SMA及波形蛋白（Vimentin）水平升高，同时予NLRP3抑制可减轻上述变化，提示GATA6可通过NLRP3促进气管上皮细胞EMT发生。气管上皮细胞LPS+Nigericin处理导致共培养的成纤维细胞collagen1a1、α-SMA及组织金属蛋白酶抑制因子1（Tissue inhibitor of metalloproteinase1,TIMP1）表达增加，而上皮细胞MCC950预处理或GATA6沉默后上述变化显著减轻；上皮细胞GATA6过表达促进共培养的RTF细胞collagen1a1、α-SMA及TIMP1产生，提示GATA6可通过调控上皮细胞来源的NLRP3炎症小体间接促进成纤维细胞激活及胶原沉积。<br>　　（3）成纤维细胞：TGF-β1处理导致RTF和HTGF细胞GATA6和ECM（collagen1a1、fibronectin和α-SMA）水平增加。沉默GATA6导致TGF-β1诱导的RTF和HTGF细胞增殖、分化和ECM沉积减少，细胞凋亡水平增加。过表达GATA6后，RTF细胞增殖、分化和ECM合成增多，细胞凋亡水平下降。<br>　　体内研究：慢病毒注射显著下调大鼠气管GATA6水平。气管损伤后第2天及第8天，与阴性对照组相比，GATA6敲低组大鼠血清NLRP3炎症小体、IL-1β及IL-18减少，气管组织GATA6、NF-κB通路激活水平、NLRP3炎症小体及焦亡水平显著降低。损伤后第8天，与阴性对照组相比，GATA6敲低组大鼠气管狭窄程度、肉芽组织胶原纤维沉积、EMT及ECM含量明显减少。<br>　　结论：（1）气管损伤导致纤维化修复，GATA6在气管肉芽组织上皮细胞和成纤维细胞高度表达，其作用与NLRP3和α-SMA相关。血清GATA6、NLRP3炎症小体、IL-1β及IL-18水平可能作为鉴别诊断气管损伤的有效标志物。<br>　　（2）GATA6通过协同NF-κB靶向促进NLRP3激活，诱导NLRP3炎症小体活化介导的气管上皮细胞焦亡，进而导致EMT发生，间接促进成纤维细胞激活及胶原沉积。<br>　　（3）GATA6直接促进气管成纤维细胞激活及分泌细胞外基质、减少细胞凋亡，诱导气管损伤后纤维化修复。<br>　　（4）GATA6下调可抑制气管损伤后NLRP3炎症小体活化、细胞焦亡及纤维化。靶向抑制GATA6在一定程度上减轻气管损伤后异常修复，GATA6可能作为气管损伤及气管狭窄潜在的有效诊断和治疗靶点。