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摘要目的：<br>　　APP（amyloid precursor protein，淀粉样前体蛋白)被BACE1（β-site APP cleaving enzyme-1，β-分泌酶1）剪切是产生毒性Aβ（β-amyloid peptide，淀粉样蛋白）的必要前提，减少BACE1蛋白表达能显著地减轻Aβ沉积和AD（Alzheimer''s Disease，阿尔茨海默病）病理改变。前期基于BACE1启动子的荧光素酶活性的药物筛选，我们得到了天然小分子药物Conophylline（CNP），已知CNP的直接配体蛋白是ARL6IP1（ADP-ribosylation factor-like6-interacting protein1，二磷酸腺苷核糖基化因子6相互作用蛋白1）。<br>　　研究目的：探讨小分子药物CNP对AD的病理改变是否具有改善作用，以及其配体蛋白ARL6IP1是否参与CNP对AD的病理改变的改善作用，并且探究CNP的具体的作用机制。<br>　　研究方法：<br>　　1.采用WB的方法检测人源性（SH-SY5Y）和小鼠源性（HT22）细胞中CNP干预后Aβ代谢相关蛋白：APP、ADAM10、BACE1、sAPPα/β、α/β-CTFs的表达变化情况；建立浓度/时间-效应曲线。采用ELISA的方法检测CNP干预后SH-SY5Y细胞内及培养基中Aβ40和Aβ42的量。采用免疫荧光的方法检测SH-SY5Y、BV-2、U251MG细胞中CNP干预后的BACE1的荧光强度变化情况。采用RT-qPCR的方法检测SH-SY5Y细胞中CNP干预后BACE1mRNA水平的变化情况；利用WB检测SH-SY5Y细胞在溶酶体抑制剂CQ、蛋白酶体抑制剂MG132、转录抑制剂ActD、翻译抑制剂CHX分别干预后CNP对BACE1的下调作用是否被阻断，从而探寻CNP作用的发挥是通过何种途径。采用荧光素酶报告基因的方法，在SH-SY5Y细胞转染含/不含BACE15''UTR的荧光素酶质粒后再进行CNP干预，检测荧光素酶活性改变，以明确CNP对BACE1的调控作用是否依赖于BACE15''UTR。<br>　　2.建立药物-时间曲线：采用HPLC-MS/MS（high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，高效液相色谱-串联质谱）的方法检测4月龄WT小鼠腹腔注射CNP不同时间后脑组织及血浆中CNP的浓度。利用同窝别的8月龄雄性WT、APP/PS1小鼠，腹腔注射CNP（1μg/kg）或生理盐水，隔日一次，连续2月，然后进行Morris水迷宫，采用ELISA方法测定小鼠脑内Aβ表达情况，采用WB检测APP的β-分泌酶分解途径相关蛋白的表达水平，探讨CNP对WT、APP/PS1小鼠的空间学习记忆能力和AD样病理改变的作用。利用窝别、体重相近3月龄雄性5×FAD小鼠，分为三组，分别腹腔注射CNP（10μg/kg）、BACE1抑制剂LY2811376（10mg/kg）、生理盐水，连续注射5天后采用WB的方法检测全长SEZ6、分泌型SEZ6、sAPPα/β、α/β-CTFs，以对比CNP与已知BACE1抑制剂的作用。<br>　　3.在SH-SY5Y细胞中转染CNP的已知药物配体蛋白ARL6IP1的siRNA，采用WB、ELISA的方法检测BACE1及细胞内/培养基中Aβ的表达；并在转染ARL6IP1的siRNA后再进行CNP干预，再采用WB、荧光素酶的方法检测ARL6IP1的沉默是否阻断CNP对BACE1的调控，从而在细胞层面明确CNP对BACE1的调控是否依赖于药物配体蛋白。采用窝别、体重相近的6月龄雄性APP/PS1模型小鼠，海马立体定位注射对照/shARL6IP1AAV（Adeno associated virus，腺相关病毒），1个月后再腹腔注射10μg/kg的CNP或生理盐水，隔日一次，共注射2个月。然后进行Morris水迷宫、旷场实验，探讨沉默ARL6IP1对APP/PS1小鼠的空间学习记忆能力的作用及对CNP作用的影响；然后通过免疫组化、免疫荧光检测各组小鼠脑切片中的淀粉样斑块，通过免疫荧光了解胶质细胞IBA1、GFAP、BACE1荧光表达情况，通过FJC、TUNEL染色了解退行神经元数量及凋亡率；通过ELISA方法测定小鼠脑内Aβ，通过WB检测AD的β-分泌酶分解途径相关蛋白，探究沉默ARL6IP1后CNP对APP/PS1小鼠的空间学习记忆能力和AD病理改变的作用，在动物层面明确CNP对BACE1的调控是否依赖于药物配体蛋白。<br>　　4.采用RNA-seq（RNA sequencing，转录组测序）的方法检测SH-SY5Y-APP细胞中CNP干预后的DEGs（Differential expressed genes，差异表达基因），以寻找CNP作用机制的线索。采用RNA-pull down联合质谱的方法寻找SH-SY5Y细胞中与BACE15''UTR结合的RBPs（RNA binding proteins，RNA结合蛋白），将其与DEGs比对，寻找交集蛋白，通过WB检测沉默这些蛋白后CNP对BACE1的下调作用是否被阻断。<br>　　通过蛋白-蛋白结合预测寻找可能与CNP配体蛋白ARL6IP1有结合的BACE15''UTR RBPs，并采用CO-IP（Co-Immunoprecipitation，免疫共沉淀）的方法验证二者是否有相互作用。在SH-SY5Y细胞中沉默ARL6IP1的互作蛋白FXR1、FXR2，再进行CNP干预，WB检测CNP对BACE1的作用是否被阻断。通过荧光素酶报告基因的方法检测SH-SY5Y细胞中FXR1的沉默是否阻断CNP对BACE1的调控，以明确CNP对BACE1的调控作用是否依赖于RBP FXR1。<br>　　5.采用CO-IP的方法检测CNP干预后SH-SY5Y细胞中ARL6IP1与FXR1的结合改变情况。采用免疫荧光的方法检测CNP干预后SH-SY5Y细胞中ARL6IP1与FXR1的共定位情况。基于MS2-MCP和VN-dEcCas6-VC系统，通过FXR1的免疫标记，检测SH-SY5Y细胞中FXR1与BACE15''UTR的共定位情况。采用RIP（RNA immunoprecipitation，RNA免疫沉淀）结合RT-qPCR的方法检测SH-SY5Y细胞中CNP干预后FXR1与BACE15''UTR的结合情况。<br>　　6.采用鼠源BACE15''UTR进行RNA-pull down，然后WB验证下拉产物中的FXR1。CO-IP的方法检测HT22细胞中CNP干预后ARL6IP1与FXR1的结合改变情况。利用14.5d左右的ICR孕鼠，对其胎鼠进行BACE15''UTR-MS2、GFP-MCP质粒的胚胎电转，麻醉苏醒后再对其腹腔注射10μg/kg的CNP或者生理盐水，直至胎鼠出生，再取新生小鼠脑组织进行冰冻切片，然后用免疫荧光的方式检测GFP标记的5''UTR-FXR1的共定位情况。<br>　　研究结果：<br>　　1.CNP选择性降低了BACE1、Aβ的蛋白水平；CNP通过依赖于5''UTR的方式抑制了BACE1翻译。<br>　　2.CNP能透过血脑屏障；CNP通过抑制BACE1改善APP/PS1小鼠的认知功能和AD样病理。<br>　　3.ARL6IP1介导CNP对AD样病理、认知功能的改善。<br>　　4.ARL6IP1与BACE15''UTR的RBP（FXR1/FXR2）有相互作用，FXR1的沉默阻断了CNP对BACE1的下调作用，CNP对BACE1的调控依赖于FXR1。<br>　　5.在人源细胞中，CNP促进ARL6IP1-FXR1相互作用，抑制FXR1-5''UTR结合。<br>　　6.在小鼠中，CNP增加ARL6IP1-FXR1相互作用，减少FXR1-5''UTR结合。<br>　　结论：<br>　　在配体ARL6IP1的介导下，能穿透血脑屏障的小分子CNP可通过5''UTR抑制BACE1的翻译、减弱淀粉样变性，改善APP/PS1小鼠的认知功能。CNP增加ARL6IP1与BACE15''UTR的RBP FXR1的相互作用，使得FXR1与5''UTR结合减少，引起BACE1的翻译减少。总的来说，CNP通过ARL6IP1表现出对AD的治疗潜力，在BACE1的翻译控制中FXR1-5''UTR的动态相互作用也是亮点。