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摘要瘤胃纤毛虫作为占据瘤胃总物质量50%的微生物，通过与其它瘤胃微生物之间的捕食、竞争及共生等关系调节着瘤胃的微生态系统，并在碳水化合的降解方面发挥着重要的作用。瘤胃纤毛虫属于真核单细胞生物，具有双核特征，由于其难于纯培养且具有大量的形态种，使得它们的系统进化关系及生态功能没有得到充分的确定及解析。本研究我们从形态学观察、大核单细胞测序、碳水化合物酶的鉴定及其功能验证等方面解析瘤胃纤毛虫的分类及其在瘤胃中的适应性进化。主要研究结果如下：<br>　　1. 瘤胃纤毛虫的分类及系统进化。本研究我们从健康的 5 头关中奶山羊、6 头荷斯坦奶牛、3 头秦川牛的瘤胃内容物中共采集了 69 个瘤胃纤毛虫，其代表了 97%属级丰度的 22 个瘤胃纤毛虫形态种。通过使用普通光学显微镜，场发射扫描电子显微镜，激光共聚焦显微镜等观察，发现了隶属于等毛科（Isotricidae）的 2 个隐匿种，随后我们对这22个形态种进行了详细的形态学描述。利用单细胞测序技术获得了69个瘤胃纤毛虫的基因组，通过对其完整性进行评估， 52 个属于高质量的基因组（BUSCO值＞80%）。随后，结合全基因组平均核苷酸同一性（ANI），相对进化差异（RED）分析，我们重新定义了 52 个瘤胃纤毛虫中的 1 个新科，2 个新属以及 2个新种，共计 19 种瘤胃纤毛虫。最后，通过单拷贝基因构树，理清了瘤胃纤毛虫的整体系统发育关系，将19种瘤胃纤毛虫归属于2个目，3个科以及13个属。<br>　　2. 瘤胃纤毛虫新种的鉴定及发酵代谢通路重构。通过使用我们前期开发的显微图像识别与鉴定网站，我们发现了一个外形呈现三角形的瘤胃纤毛虫新种（命名为Isotricha_A mobula）。通过系统发育树的构建，结果显示其与原口等毛虫（Isotricha_A prostoma）互为姐妹枝。该物种的发现再次补充了瘤胃纤毛虫的种类，为更深层地理解等毛科的进化提供可能。瘤胃纤毛虫代谢通路的重构发现约80%的瘤胃纤毛虫可以编码乙酸盐产生途径，却缺少完整的丁酸，丙酸代谢通路的编码。<br>　　3. 瘤胃纤毛虫碳水化合物酶（CAZymes）的投资权衡及来源鉴定。53 个瘤胃纤毛虫预测到了43,901个CAZymes蛋白，按照identity值99%进行cd-hit去冗余，仅有 1%的 CAZymes 簇与公共数据库序列相似性达到 95%及以上，这些结果说明瘤胃纤毛虫编码大量新型的碳水化合物酶。尤其对于双毛亚科（Diplodininae）和头毛亚科（Ophrystocolecinae）作为编码着与肠道真菌相当的CAZymes，这两个亚科所属物种 编 码的 CAZymes 比 內毛 亚 科（ Entodininae ）和 等 毛科 / 反刍 厚 科（Isotricidae/Dasytricidae）分别高出2倍和5倍，建议Diplodininae和Ophrystocolecinae在降解碳水化合物方面扮演着重要角色。另外，每个科/亚科不仅可以编码多种酶类以协同降解单一种类的多糖，也可以在科/亚科之间通过降解不同的底物以避免生态位的重叠。本研究发现Diplodininae和Ophrystocolecinae偏向结构性碳水化合物的降解，如纤维素，半纤维素，果胶等，而Entodininae、Isotricidae和Dasytricidae偏向非结构性碳水化合物的降解，如淀粉，果聚糖等。最后，结合BLAST和系统发育技术分析，发现瘤胃纤毛虫60%的CAZymes编码基因通过水平基因转移（HGT）获得。其中，52%的HGT基因是从细菌中获得，共计16,379个，主要是来自厚壁菌和拟杆菌，8%来自真菌（2,245个）。其次，我们也发现Isotricidae/Dasytricidae的纤毛虫有更多的HGT是通过真菌获得。<br>　　4. 瘤胃纤毛虫水 HGT 获得的 CAZymes 的功能鉴定。从判定为 HGT 来源的CAZymes中，我们挑选35个进行基因的合成，本研究成功表达并进行酶学性质检测的有9个，分别是2个纤维素酶，3个木聚糖酶，2个甘露聚糖酶，1个果胶酶，1个溶菌酶。另外，为了比较HGT假定供体物种与瘤胃纤毛虫CAZymes之间的活性，我们也成功表达了2个假定供体物种的CAZymes。结果显示HGT获得的瘤胃纤毛虫纤维素酶OCCel1A，木聚糖酶OGXyn1A的比活分别比假定供体物种高9倍和2倍，序列结构显示纤毛虫CAZymes的序列比假定供体物种少一个基序。酶动力学结果显示瘤胃纤毛虫OGXyn1A底物结合能力高于假定供体物种。该结果说明瘤胃纤毛虫HGT获得的CAZymes增强了其对碳水化合物的降解，使其更好的适应了瘤胃高碳水化合物的环境。其次，通过对瘤胃纤毛虫HGT获得的CAZymes酶学性质的测定，结果表明瘤胃纤毛虫大多数编码的CAZymes最适温度保持在45~60℃，最适pH为5.0~6.5。另外，将木聚糖酶在40℃最适pH缓冲液中处理24h，它们的酶活仍保持在65%以上。这些结果再一次说明瘤胃纤毛虫对瘤胃环境的适应性。最后，除了已经预测到具有EC号酶的GH结构之外，我们也证明了一个GH19家族的蛋白具有较高的溶菌酶活性，比活达 36,007U/mg，其对藤黄微球菌具有显著抑制作用。上罐发酵结果显示随着上罐时间的推移，酶活逐渐升高。<br>　　综上所述，本研究获得的高质量瘤胃纤毛虫基因组目录，对于其系统进化关系的确定及生态功能的解析提供了可能。瘤胃纤毛虫编码的大量具有高活性的CAZymes，对其自身的适应性进化具有重要意义。另外，作为CAZymes的新型来源材料，瘤胃纤毛虫为将来畜禽饲料，生物质转化、抗菌药的开发提供了巨大潜能。