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摘要目的：<br>　　奥希替尼作为第三代EGFR-TKI药物治疗NSCLC效果显著。然而伴随用药时间的延长，奥西替尼的耐药是不可避免的。EMT是奥希替尼常见的耐药机制之一，目前缺少有效的应对措施。本课题拟建立奥希替尼EMT耐药细胞株H1975/OE，对比EMT相关标记物的变化，分析耐药机制。添加siRNA和 DHA，对比分析亲本细胞与耐药细胞的mRNA、蛋白表达变化，以期为奥希替尼EMT耐药的患者提供后续的治疗策略。<br>　　方法：<br>　　在第一部分实验中，选用T790M突变的LUAD细胞株NCI-H1975（H1975）为亲本细胞，通过奥希替尼的梯度浓度诱导建立耐药细胞H1975/OA。利用Transwell细胞实验、划痕实验对比H1975与H1975/OA的迁移、侵袭能力；利用流式细胞术对比亲本与耐药细胞的凋亡和周期。通过高倍显微镜对比亲本与耐药细胞在形态和生物特性的不同，在全部H1975/OA中筛选出侵袭能力增强的耐药细胞株，即认为其发生了EMT，命名为H1975/OE。<br>　　在第二部分实验中，利用WB、qPCR检测对比H1975与H1975/OE中EMT相关标志物的mRNA和蛋白表达水平的不同。利用siRNA对H1975/OE中的EMT关键转录分子Slug进行转染，探索Slug是否可以影响H1975/OE的EMT相关标记物表达。比较H1975、H1975/OE以及H1975/OE-Slug-siRNA（H1975/OE-Ss）三组细胞株中EMT相关标志物的蛋白和mRNA表达水平，对比H1975/OE与H1975/OE-Ss生物特性的不同。<br>　　在第三部分实验中，利用不同浓度DHA抑制Slug的表达，探索DHA是否影响肺腺癌的奥希替尼EMT耐药。检测H1975/OE+1nmol/L奥希替尼+不同浓度DHA模型中不同时间段的细胞存活率。检测H1975、H1975/OE以及H1975/OE+40μmol/L DHA三组细胞株中EMT相关标志物的蛋白和mRNA表达水平。对比H1975/OE与H1975/OE+40μmol/L DHA生物特性。对比H1975/OE与H1975/OE+40μmol/L DHA中EMT肿瘤相关信号通路中关键蛋白的变化情况。<br>　　结果：<br>　　在第一部分实验中，H1975/OA通过奥希替尼梯度浓度诱导法成功建立，共计传代培养10代，历经22个月。通过计算，IC50值约为292.6nmol/L，耐药指数为298。通过细胞形态、生物学特征从全部奥希替尼耐药细胞株中选出发生EMT的细胞株H1975/OE，其总数约占此次实验建立的全部奥希替尼耐药细胞的4%左右。100倍显微镜下观察，H1975/OE细胞核大、边界不明显，上皮表型丧失。与H1975相比，H1975/OE的G2、M周期阻滞，倍增时间延长，表现出迁移与侵袭能力增强的特征。<br>　　在第二部分实验中，与H1975相比，H1975/OE中作为侵袭促进因子的Slug和作为肿瘤侵袭启动子的N-cad的蛋白与mRNA表达水平均升高，而作为肿瘤细胞间的黏附分子E-cad的蛋白和mRNA表达水平均下调。通过Slug-siRNA转染后，在H1975/OE-Ss中：Slug蛋白和mRNA表达水平与H1975差异不显著；E-cad蛋白表达上调，高于H1975/OE而低于H1975，且与H1975和H1975/OE的差异均显著，其mRNA水平上调，与亲本细胞差异不显著；N-cad蛋白和mRNA表达水平均下调，低于H1975/OE、高于H1975，且与H1975和H1975/OE的差异均显著。与H1975/OE对比，H1975/OE-Ss的侵袭迁移能力减弱。<br>　　在第三部分的实验中，当DHA浓度分别为10、20μmol/L时，对H1975/OE细胞的抑制无明显统计学差异；当DHA浓度为40μmol/L时，对H1975/OE的抑制能力显著。因此，本实验使用40μmol/L的DHA作用于H1975/OE。在H1975/OE-HDHA中：Slug的蛋白与mRNA表达水平均下调，与H1975和H1975/OE的差异均显著；E-cad的蛋白表达与H1975/OE无明显差异，其mRNA水平上调，与H1975/OE差异显著，与H1975差异不显著；N-cad的蛋白与mRNA表达水平均下调，与H1975/OE的差异显著，与H1975差异不显著。与H1975/OE对比，H1975/OE-HDHA的侵袭迁移能力减弱。40μmol/L DHA可以抑制β-catenin和NF-κB p65的表达来阻断Wnt和NF-κB信号通路的传导，对Smad4的蛋白表达无明显影响。<br>　　本实验在体外环境下成功模拟了肺腺癌奥希替尼耐药的过程，筛选出EMT耐药的细胞株H1975/OE，明确了EMT在全部奥希替尼耐药机制中的占比。证实了DHA可以通过抑制部分关键蛋白的表达来逆转奥希替尼EMT耐药的进程。