检索历史 清除

摘要目的：明确DPP3与胃癌病理进程的相关性，揭示DPP3抑制胃癌进展的生物学作用并初探其作用机制；为胃癌的分子分型及相应的靶向治疗开发提供数据基础。<br>　　方法：收集自2017年至2019年行胃癌根治术，并经病理诊断为胃癌的石蜡组织切片和相应癌旁组织切片各59例，免疫组织化学检测DPP3的表达情况。在多株人胃癌细胞系中检测DPP3的内源性表达情况，分别选取内源性高表达和低表达DPP3的胃癌细胞系实施后续细胞表型实验。使用CRISPR-Cas9技术和转染过表达质粒的方法分别构建DPP3稳定敲除和稳定过表达的胃癌细胞系，使用Sanger测序、RT-qPCR和WesternBlot方法验证DPP3的敲除和过表达效率。实时动态细胞成像系统IncuCyteS3观察DPP3对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。MTT法进一步确认增殖能力。克隆形成实验检测DPP3对胃癌细胞体外克隆和集落形成能力的影响。流式细胞术检测DPP3对胃癌细胞凋亡的影响。使用三维低氧多通道成像仪检测DPP3对胃癌细胞周期的影响。选取DPP3敲除及其亲本细胞系，进行全转录组测序，经生物信息学分析结合上述细胞表型结果，初步锁定DPP3影响胃癌进展的机制分子。通过RT-qPCR和WesternBlot观察并验证下游机制分子的表达情况。<br>　　结果：DPP3在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织（P＜0.001），其表达水平与胃癌分化程度呈正相关。CRISPR-Cas9敲除DPP3实验操作后，Sanger测序结果显示位于DPP3第3号外显子的243位至335位的62个碱基对被成功敲除，敲除碱基对为非3的倍数，提示发生移码突变，表明已成功构建DPP3双等位基因敲除胃癌细胞系，命名为DPP3-KOMKN-45。与亲本细胞（DPP3-PMKN-45）相比，DPP3在敲除组的mRNA表达量下降80%，差异具有统计学意义（P＜0.0001），蛋白水平未见表达。成功构建了DPP3稳定过表达细胞系，命名为DPP3-OEMGC-803：RT-qPCR结果显示，与亲本细胞（DPP3-PMGC-803）相比，DPP3在稳转细胞株中的表达增高约20倍，差异具有统计学意义（P＜0.001）；WesternBlot验证DPP3的蛋白表达情况，DPP3在稳转细胞株中显著高表达。IncuCyteS3结果显示：与DPP3-PMKN-45相比，DPP3-KOMKN-45的细胞增殖、迁移、侵袭能力均增强（P＜0.05）；与DPP3-PMGC-803相比，DPP3-OEMGC-803组细胞增殖、迁移、侵袭能力均减弱（P＜0.05），细胞水平证明了DPP3对胃癌进展的抑制作用。MTT和克隆形成结果显示，与各自亲本细胞相比，DPP3-KOMKN-45的细胞活力和体外克隆形成能力增强（P＜0.05），而DPP3-OEMGC-803减弱（P＜0.05）。流式分析表明，与各自亲本细胞相比，DPP3-KOMKN-45和DPP3-OEMGC-803细胞凋亡均无明显改变，差异无统计学意义（P＞0.05）。对细胞分裂情况进行实时监测得知DPP3-KOMKN-45分裂时间较DPP3-PMKN-45细胞时间缩短，差异具有统计学意义（P＜0.05）；DPP3-PMGC-803细胞需要更多的时间分裂，差异具有统计学意义（P＜0.05）。通过转录组测序获得由DPP3差异表达所致的差异表达基因谱，经生信分析结合细胞周期的表型结果，聚焦于细胞周期通路关键基因：细胞周期蛋白依赖性激酶12（cyclin-dependentkinases12，CDK12）。RT-qPCR和WesternBlot实验结果显示：与DPP3-PMKN-45相比，在DPP3-KOMKN-45细胞中，CDK12的表达无论在mRNA水平（P＜0.01）还是在蛋白水平（P＜0.05）均有增高；而作为平行对照的CDK4和CDK6在mRNA及蛋白水平均未发现明显表达差异（P＞0.05）。<br>　　结论：DPP3在胃癌组织中的表达显著低于癌旁组织，且其表达水平与胃癌分化程度呈正相关。DPP3抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、细胞活力、体外克隆形成能力。DPP3抑制细胞增殖能力并非促进细胞凋亡，而是延长细胞周期时相所致。DPP3可能是通过调控CDK12的表达，继而延长细胞周期时相来发挥抑癌功能。