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摘要目的：<br>　　本研究通过构建单侧输尿管阻塞(UnilateralUreteralObstruction，UUO)诱导的大鼠体内纤维化模型和体外使用TGF-β1刺激人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)诱导纤维化模型，了解肾康注射液对miR-21/Smad7途径的调控以及通过该途径对体内外肾纤维化相关因子的影响,旨在探讨肾康注射液通过miR-21/Smad7途径改善肾间质纤维化的作用机制。<br>　　方法:<br>　　1.构建SD大鼠的梗阻性肾病UUO模型，将60只雄性大鼠随机分为正常组、假手术组、梗阻性肾病UUO模型组（模型组）、模型组+肾康注射液低剂量组（低剂量组）、模型组+肾康注射液中剂量组(中剂量组)、模型组+肾康注射液高剂量组(高剂量组)、模型组+盐酸贝那普利(贝那普利组)。造模后3天，肾康注射液组分别按（1.35g/kg/d、2.7g/kg/d、5.4g/kg/d）剂量经腹腔注射给药；盐酸贝那普利组按0.9mg/kg/d剂量给与灌胃处理。正常组、假手术组给予治疗组同等剂量的生理盐水进行灌胃及腹腔注射。21日后处死大鼠，抽取腹主动脉血进行血清肌酐、尿素氮肾功能检测；取左侧肾脏组织进行病理检测，通过HE染色（hematoxylin-eosinstaining，苏木精-伊红染色法）、Masson以及免疫组化染色观察肾脏病理学改变情况；通过WesternBlot、Real-timePCR等技术检测Smad7、miR-21（microRNA21）、E-ca（E-cadherin）、α-SMA（α-Smoothmuscleactin）、Vim（Vimentin）、FN（Fibrinogen）、COLI（collagenⅠ）、COLⅢ（collagenⅢ）表达情况。<br>　　2.用不同浓度的TGF-β1（transforminggrowthfactor-β1）刺激HK-2细胞，通过α-SMA的蛋白和miR-21的表达量寻找TGF-β最合适的刺激浓度。运用细胞转染技术，按照30、50、100nM的不同浓度的siRNA转染细胞，利用PCR试验方法，筛选出最合适的转染浓度。将细胞分为HK-2细胞+NCinhibitor组（NC组）、HK-2细胞+TGF-β1组+NCinhibitor组（NC+TGF-β1组）、HK-2细胞+TGF-β1+miR-21inhibitor（in-miR-21+TGF-β1组）分别给与细胞一定刺激，利用Real-timePCR技术手段检测Smad7、FN、COLI、COLⅢ的表达量。利用双荧光素酶实验研究miR-21与Smad7之间的靶向关系。<br>　　3.通过CCK8检测不同浓度下细胞增殖活性，筛选出适宜浓度作为体外治疗的剂量。用10ng/ml浓度的TGF-β刺激HK-2细胞，24h后按（2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml）不同浓度肾康注射液（Shenkanginjection，SKI）给予治疗。利用WesternBlot、Real-timePCR等技术检测Smad7、α-SMA、Vim、FN、COLI、COLⅢ、miR-21表达情况。实验的最后将细胞分为HK-2细胞+NCinhibitor组（NC组）、HK-2细胞+TGF-β1组+NCinhibitor组（NC+TGF-β1组）、HK-2细胞+TGF-β1+miR-21inhibitor（in-miR-21+TGF-β1组）、HK-2细胞+TGF-β1+NCinhibitor+SKI（NC+TGF-β1+SKI组）分别给与细胞一定刺激，利用Real-timePCR技术手段检测Smad7、FN、COLI、COLⅢ的表达情况。<br>　　结果:<br>　　1.（1）大鼠的基本情况：正常组及模型组皮毛油量、反应敏捷及尿量正常；模型组毛发干枯、反应迟钝、尿量明显减少；各治疗组的大鼠基本情况介于两者之间。（2）血清肌酐、尿素氮检测结果：模型组中的血清肌酐及尿素氮表达水平显著高于正常组（Plt;0.01）；各治疗组中血清肌酐及尿素氮表达水平均明显低于模型组（Plt;0.05），且各治疗组之间差异不具有统计学意义（Pgt;0.05）。（3）肾脏大体形态学观察：正常组及假手术组肾脏大小一致，包膜紧实有光泽；模型组肾脏体积增大，形状不规则；各治疗组的肾脏大体变化情况介于正常组与模型组之间，其中贝那普利组大鼠的肾脏组织尿液潴留情况比其他药物组略微严重一点。其余肾康注射液各治疗组之间，肾脏的大小、颜色及形状的改变，通过肉眼观察没有看到明显的差异。（4）HE及Masson染色结果：正常组及假手术组肾小球、肾小管结构未见明显特殊改变，肾间质区域未见胶原阳性染色；模型组肾小球萎缩、肾小管挤压变形，间质大量炎细胞浸润，纤维组织增生、玻璃样变，肾间质区域见大量胶原阳性染色；其余各治疗组的肾间质炎细胞浸润，纤维组织增生、玻变等情况与模型组相比较明显减轻；同时各治疗组胶原染色阳性区域对比模型组也明显较少。（5）免疫组织化学染色结果：α-SMA、COLI的蛋白在正常组与假手术组中未见阳性表达；模型组间质区域可见大量棕黄色颗粒沉积；各治疗组与模型组相比，COLⅠ、α-SMA的阳性区域有较为明显的减少。E-ca的表达情况与之相反。（6）miR-21、α-SMA、Vim、FN、COLI、COLⅢ的表达水平：与正常组相比，模型组中这些分子的表达量显著升高（Plt;0.01）；各治疗组与模型组相比，其表达量显著下降（Plt;0.01）。（7）Smad7mRNA及蛋白表达量：与正常组相比，模型组中的表达量显著下降（Plt;0.01）；各治疗组与模型组相比，其表达量显著升高（Plt;0.05）。<br>　　2.（1）造模后的HK-2细胞中miR-21、α-SMA的表达量随TGF-β1的刺激浓度增加而增加。（2）当转染浓度为100nM时，转染效率最高。（3）沉默HK-2细胞中miR-21表达后，in-miR-21+TGF-β组中FN、COLI、COLⅢ表达量比NC+TGF-β组中的显著降低（Plt;0.01）。而两组相比较时in-miR-21+TGF-β组中<br>　　Smad7的表达量显著提高（Plt;0.05）。（4）双荧光素酶实验证实了miR-21对Smad7有明确的靶向调控作用。<br>　　3.（1）当肾康注射液的治疗浓度为8mg/kg作用24h时，HK-2细胞的增殖活力最高。（2）给予造模的HK-2细胞适宜浓度的肾康注射液治疗后，模型组中miR-21、FN、COLI、COLⅢmRNA的表达量和α-SMA、Vim、COLI的蛋白表达量显著高于对照组（Plt;0.01）。同时，与模型组相比各治疗组中均表现为明显下降（Plt;0.01）。与此相反，与正常组相比，模型组中Smad7表达量显著下降（Plt;0.01）。与模型组相比各治疗组中Smad7的蛋白水平和mRNA水平得到显著的提高（Plt;0.05）。（3）沉默HK-2细胞中miR-21表达后给予肾康注射液治疗，in-miR-21+TGF-β组中的FN、COLI、COLⅢ的mRNA表达量和NC+TGF-β+SKI组中的相比，没有明显差异（Pgt;0.05）。<br>　　结论:<br>　　1.肾康注射液可改善UUO大鼠的基本情况，减轻其肾功能损害，减缓肾小管上皮细胞间充质转分化的发生发展，减少细胞外基质的分泌沉积。<br>　　2.miR-21能够通过抑制Smad7表达促进肾纤维化的形成。<br>　　3.肾康注射液可通过miR-21/Smad7途径改善肾间质纤维化。