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基于Ang/Tie2信号通路探讨芪灯明目胶囊治疗视网膜新生血管的作用机制

摘要目的:建立氧诱导视网膜病变(Oxygen-inducedRetinopathy,OIR)小鼠模型,探讨芪灯明目胶囊对血管生成素(Angiopoietin,Ang)/酪氨酸激酶受体Tie2信号通路(Ang/Tie2信号通路)的调控作用以及其对视网膜新生血管(Retinalneovascularization,RNV)的干预效应,明确芪灯明目胶囊治疗RNV的作用机制,为其临床应用提供实验和理论依据。<br>  方法:取健康新生7天(P7)C57BL/6J幼鼠120只,随机分为OIR模型组100只和正常对照组20只。正常对照组小鼠一直在正常空气环境中饲养,OIR组所有小鼠及其哺乳母鼠在氧气浓度为(75%±2%)的自制玻璃氧舱内饲养5天,至P12时移出氧舱,随机分为模型对照组(OIR组)、芪灯明目胶囊低剂量组、中剂量组和高剂量组以及阳性药物组(Ang1组),然后于正常环境中继续饲养5天至P17,期间予以药物干预。芪灯明目胶囊低、中、高剂量组采取芪灯明目胶囊混悬液(225mg/kg、445mg/kg、900mg/kg)灌胃,Ang1组于P12时予以Ang1(0.05μg,1μl)双眼玻璃体注射一次。所有小鼠于P17时行相关检测:(1)OIR小鼠模型评价及芪灯明目胶囊对RNV的干预效应研究:①制作小鼠眼球组织病理切片HE染色,统计突出内界膜的血管内皮细胞核数目,评价RNV生长情况。②FITC-dextran荧光造影并制作视网膜铺片,直观显示视网膜无灌注区,血管形态、分布及密度;(2)芪灯明目胶囊对小鼠RNV的重塑效应研究:①免疫荧光双染检测视网膜周细胞标志物α-SMA与血管内皮细胞标志物CD31表达与分布,评价视网膜血管周细胞覆盖程度;②免疫组织化学法检测视网膜缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-induciblefactor-1α,HIF-1α)和血管内皮钙黏着蛋白<br>  (Vascularendothelialcadherin,VE-cadherin)的蛋白表达量,评价视网膜组织缺氧情况以及血管完整性。(3)芪灯明目胶囊对Ang/Tie2信号通路的调控作用研究:同时采用免疫组织化学法以及WesternBlot检测小鼠视网膜组织Ang/Tie2信号通路主要成员Ang1、Ang2、Tie2以及其下游信号-磷酸化的蛋白激酶B(P-AKT)和内皮细胞型一氧化氮合酶(Endothelialcellnitricoxidesynthase,eNOS)的蛋白表达量。<br>  结果:(1)OIR小鼠模型评价以及芪灯明目胶囊对RNV的干预效应研究结果显示:①眼球病理切片HE染色:a.与正常对照组相比,OIR组突破内界膜的血管内皮细胞核数目明显增多(Plt;0.01);b.与OIR组相比,各治疗组突破内界膜的血管内皮细胞核数目明显减少(Plt;0.01);c.各治疗组间比较,芪灯明目胶囊三个剂量组之间无统计学差异(Pgt;0.05);Ang1组突破内界膜的血管内皮细胞核数目少于芪灯明目胶囊高剂量组(Plt;0.05);②视网膜铺片:视网膜无灌注区面积:OIR组小鼠视网膜无灌注区面积大于正常对照组(Plt;0.05);芪灯明目胶囊各剂量组无灌注区面积和OIR组无统计学差异(Pgt;0.05);Ang1组无灌注区面积小于OIR组(Plt;0.05)。视网膜新生血管密度:OIR组小鼠视网膜新生血管密度大于正常对照组(Plt;0.05);芪灯明目胶囊中、高剂量组以及Ang1组视网膜新生血管密度小于OIR组(Plt;0.05)。视网膜总血管密度:各组间视网膜总血管密度不具备统计学差异(F=1.044,P=0.411)。<br>  (2)芪灯明目胶囊对小鼠RNV的重塑效应研究结果:①免疫荧光检测CD31与α-SMA:a.与正常对照组相比,OIR组CD31平均荧光强度显著升高(Plt;0.01),α-SMA平均荧光强度显著降低(Plt;0.01);b.与OIR组相比,各治疗组CD31表达减少(Plt;0.05),芪灯明目胶囊中剂量组α-SMA水平增高(Plt;0.05),芪灯明目胶囊高剂量组与Ang1组α-SMA水平显著增高(Plt;0.01);c.各治疗组间比较,芪灯明目胶囊三个剂量组存在剂量效应关系,低剂量组与高剂量组CD31和α-SMA水平存在显著差异(Plt;0.01),中、高剂量组α-SMA水平存在显著差异(Plt;0.01),高剂量芪灯明目胶囊组与Ang1组的CD31和α-SMA水平均相当(Pgt;0.05)。②免疫组织化学法检测视网膜HIF-1α和VE-cadherin表达:a.与正常对照组相比,OIR组HIF-1α表达增加(Plt;0.05),VE-cadherin表达减少(Plt;0.05);b.与OIR组相比,芪灯明目胶囊中剂量组VE-cadherin增高(Plt;0.05);芪灯明目胶囊高剂量组VE-cadherin表达增高(Plt;0.05),HIF-1α减少(Plt;0.05);Ang1组HIF-1α减少(Plt;0.05),VE-cadherin显著升高(Plt;0.01);c.各治疗组间比较,芪灯明目胶囊各剂量组不存在剂量效应关系(Pgt;0.05);芪灯明目胶囊高剂量组HIF-1α和VE-cadherin表达水平与Ang1组相当(Pgt;0.05)。<br>  芪灯明目胶囊对Ang/Tie2信号通路的调控作用研究结果:①免疫组织化学法检测结果:a.与正常对照组相比,OIR组Ang1无明显变化(Pgt;0.05),Ang2显著增加(Plt;0.01),Tie2表达减少(Plt;0.05),P-AKT和eNOS显著减少(Plt;0.01);b.与OIR组相比,芪灯明目胶囊低剂量组Ang1增高(Plt;0.05),Ang2减少(Plt;0.05);芪灯明目胶囊中剂量组Ang2减少(Plt;0.05),P-AKT和eNOS增高(Plt;0.05);芪灯明目胶囊高剂量组Ang2减少(Plt;0.05),Tie2和P-AKT增高(Plt;0.05),Ang1和eNOS显著升高(Plt;0.01);Ang1组Ang2无明显变化(Pgt;0.05),Tie2和P-AKT增高(Plt;0.05),Ang1和eNOS显著升高(Plt;0.01);c.各治疗组间比较,芪灯明目胶囊仅低剂量与高剂量组的Ang1、Tie2、P-AKT和eNOS表达有统计学差异(Plt;0.05),Ang1组eNOS表达水平较芪灯明目胶囊高剂量组升高,具有统计学差异(Plt;0.05);其余各组间比较无统计学差异(Pgt;0.05)。<br>  ②Western-Blot检测结果:a.OIR组较正常对照组Ang2明显增加(Plt;0.01),Ang1、Tie2、P-AKT明显减少(Plt;0.01);b.与OIR组相比,芪灯明目胶囊低剂量组Ang2表达减少(Plt;0.05);芪灯明目胶囊中剂量组Ang2表达减少(Plt;0.05),Ang1表达增加(Plt;0.05);芪灯明目胶囊高剂量组Ang2表达明显减少(Plt;0.01),P-AKT表达增加(Plt;0.05),Ang1和Tie2明显增加(Plt;0.01);Ang1组Ang2表达明显减少(Plt;0.01),P-AKT表达增加(Plt;0.05),Ang1和Tie2明显增加(Plt;0.01);c.各治疗组间比较,芪灯明目胶囊低/高剂量组以及中/高剂量组Ang2存在统计学差异(Plt;0.05),低/高剂量组Tie2表达存在统计学差异(Plt;0.05),其余各组间比较无统计学差异(Pgt;0.05)。总的来说,WesternBlot和免疫组化法检测结果大致相同,仅eNOS的表达存在较大差异,这里以WesternBlot检测的结果为准。<br>  结论:<br>  (1)芪灯明目胶囊能抑制OIR小鼠RNV形成。<br>  (2)芪灯明目胶囊能增加OIR模型小鼠视网膜血管周细胞覆盖,下调HIF-1α表达,增加VE-cadherin水平,促进视网膜血管成熟,缓解视网膜缺氧,增加血管的完整性,且存在剂量效应关系。<br>  (3)芪灯明目胶囊能上调Ang1、Tie2、P-AKT表达,下调Ang2表达,且具有剂量效应关系。通过调控Ang/Tie2信号通路,抑制RNV形成,并促进新生血管成熟重塑,保护视网膜功能。

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