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摘要目的：<br>　　肾纤维化是慢性肾脏病终末阶段的病理表现，以细胞外基质的异常沉积为特点，防治其发生发展是扼制慢性肾脏病进展的有效策略之一。肾纤维化机制复杂，单靶点抑制效果不理想，因此中医多靶点干预的整体治病理念在肾纤维化的防治中得到越来越多的关注。肾康注射液是目前治疗慢性肾脏病常用且有效的中药注射剂，但其抗纤维化的具体分子作用机制尚不明晰。本研究采用网络药理学分析肾康注射液抗纤维化的药物通路，同时结合动物、细胞实验验证其作用机制，为肾康注射液治疗慢性肾脏病提供科学依据。<br>　　方法：<br>　　网络药理学研究：使用TCMSP、GeneCards、OMIM、DisGeNET等数据库获得肾康注射液组方的活性成分及肾纤维化相关基因，对肾康注射液活性成分-药物-疾病交互靶点进行分析，根据得到的关键靶点构建蛋白质互作网络，并进行GO、KEGG富集分析。<br>　　动物实验：采用UUO建立大鼠肾纤维化模型并随机分为正常组（不做任何处理）、模型组（左侧输尿管结扎）、假手术组（操作同模型组，但不结扎输尿管）、贝那普利组（0.9mg/kg/天）及高（5g/kg/天）、中（2.5g/kg/天）、低（1.25g/kg/天）剂量肾康注射液组（每组n=6）。造模成功三天后给药，连续三周。观察大鼠一般情况，称量体重、肾脏湿重，检测肾功能，对肾组织行苏木精-伊红染色（HE）、Masson染色，以免疫组化、免疫荧光、Westernblot、RT-qPCR检测肾组织细胞外基质、上皮间质转化（EMT）及Wnt/β-catenin信号通路相关表达。<br>　　细胞实验：将HK-2细胞分为空白组（完全培养基）、模型组（终浓度为10ng/mL的TGF-β1）、肾康注射液组、ICG-001组，干预24h后采用免疫荧光染色、Westernblot、RT-qPCR法检测肾康注射液对细胞Wnt/β-catenin信号通路相关表达的影响。将HK-2细胞分为空白组、模型组、肾康注射液组、ICG-001组，采用鬼笔环肽染色、细胞划痕实验、免疫荧光染色、Westernblot、RT-qPCR评价肾康注射液对HK-2细胞转分化的影响。<br>　　结果：<br>　　网络药理学研究：肾康注射液主要活性成分135个，对应作用靶点307个，<br>　　其中119个是其抗肾纤维化的关键靶点。槲皮素、木樨草素、芹菜素、山柰酚、黄豆苷元、芦荟大黄素、芒柄花素、异鼠李素可能是其抗纤维化的主要成分。GO、KEGG富集分析结果提示，肾康注射液可能通过调节细胞迁移、细胞增殖与凋亡、细胞黏附、氧含量变化等多个生物学过程，作用于HIF-1、FoxO、JAK-STAT、T细胞受体、TGF-beta、Wnt、Hippo等多条信号通路发挥治疗作用。<br>　　动物实验：1.三周后高剂量肾康注射液组（SKI-H）、中剂量肾康注射液组（SKI-M）、低剂量肾康注射液组（SKI-L）、贝那普利组大鼠一般情况均有改善，体重较模型组增加（P＜0.01），肾脏湿重较模型组下降（P＜0.05），血清肌酐、尿素氮较模型组显著下降（P＜0.01）。HE染色：模型组肾小球玻璃样变性，肾小管萎缩，部分肾小管、集合管扩张，肾小管上皮细胞空泡化，间质纤维细胞增生，广泛炎细胞浸润；SKI-H、SKI-M、SKI-L及贝那普利组相比模型组上述组织学变化减轻。模型组与正常组、假手术组相比肾小球数量明显减少（34.17个±6.21比，88.33个±8.50，88.00个±7.32，P值均＜0.01）；SKI-H、SKI-M、SKI-L组及贝那普利组相比模型组肾小球数量增加（51.50个±4.59，46.00个±3.23，43.33个±5.16，49.83个±5.91，比34.17个±6.21，P值均＜0.01）。Masson染色：模型组大鼠肾间质可见蓝色胶原物质沉积；SKI-H、SKI-M、SKI-L及贝那普利组相比模型组胶原沉积减少。模型组较正常组与假手术组肾组织胶原容积分数（CVF）明显增加（50.45%±5.39比，7.13%±3.60，7.64%±2.50，P值均＜0.01）；而SKI-H、SKI-M、SKI-L组及贝那普利组相比模型组CVF均明显下降（27.57%±5.19，28.66%±4.44，35.25%±2.97，27.89%±4.29，比50.45%±5.39，P值均＜0.01）。细胞外基质表达：免疫组化显示模型组大鼠肾组织内可见明显ColⅠ、FN阳性颗粒沉积；SKI-H、SKI-M、SKI-L及贝那普利组较模型组阳性沉积减少。模型组与正常组、假手术组相比ColⅠ、FN表达明显增加（P＜0.01）；而SKI-H、SKI-M、SKI-L及贝那普利组相比模型组ColⅠ、FN表达下降（P＜0.05）。EMT相关表达：免疫组化显示模型组大鼠肾组织可见α-SMA阳性颗粒沉积，而E-cadherin阳性颗粒沉积减少；SKI-H、SKI-M、SKI-L及贝那普利组相比模型组α-SMA阳性沉积减少，E-cadherin阳性沉积增多。模型组相比正常组与假手术组α-SMA表达明显增加（P＜0.01），E-cadherin表达明显下降（P＜0.01）。SKI-H、SKI-M、SKI-L及贝那普利组相比模型组α-SMA表达下降（P＜0.05），而E-cadherin表达增加（P＜0.05）。Wnt/β-catenin信号通路的相关表达：免疫荧光显示UUO大鼠肾组织多种细胞均有β-catenin表达；模型组较正常组、假手术组肾组织activeβ-catenin阳性荧光信号增强；而SKI-H、SKI-M、SKI-L及贝那普利组相比模型组activeβ-catenin荧光信号减弱。免疫组化显示模型组较正常组、假手术组肾组织β-catenin阳性颗粒沉积增多，SKI-H、SKI-M、SKI-L及贝那普利组相比模型组阳性沉积减少。Westernblot蛋白半定量和RT-qPCRmRNA定量检测显示模型组通路相关蛋白（Wnt1、β-catenin、activeβ-catenin、Dvl1、TCF4、PAI-1、Snail1）及mRNA表达水平（β-catenin、Wnt1、PAI-1、Snail1、TCF4）明显增加（P＜0.01）；SKI-H、SKI-M、SKI-L组及贝那普利组相比模型组通路相关蛋白及mRNA表达水平均下降（P＜0.05）。<br>　　细胞实验：免疫荧光染色显示模型组较空白组胞质内β-catenin、activeβ-catenin荧光信号增强，核内有散在activeβ-catenin、Snail1阳性荧光信号；肾康注射液组（SKI组）与ICG-001组相比模型组β-catenin、activeβ-catenin、Snail1阳性荧光信号减弱。Westernblot蛋白半定量与RT-qPCRmRNA定量检测显示模型组蛋白（β-catenin、activeβ-catenin、PAI-1、Snail1、TCF4、Dvl1、Wnt1）与mRNA（β-catenin、PAI-1、Snail1、TCF4、Wnt1）表达水平较空白组明显增加（P＜0.01）；SKI组、ICG-001组相比模型组蛋白（β-catenin、activeβ-catenin、PAI-1、Snail1、TCF4、Dvl1）与mRNA（β-catenin、PAI-1、Snail1、TCF4）表达水平均下降（P＜0.05），SKI组较模型组与ICG-001组Wnt1表达下降（P＜0.05）。鬼笔环肽染色显示，空白组HK-2细胞为卵圆形，模型组细胞形态呈梭形；SKI组相比模型组，大部分细胞梭形改变减轻；ICG-001组少部分细胞形态有所恢复，其余细胞未见明显改变。细胞划痕实验显示，0h后空白组、模型组、SKI组、ICG-001组划痕模型构建成功，组间无明显差异；24h后经划痕比例测算，模型组较空白组划痕比例明显增大（0.8756±0.0500比0.2858±0.1692，P值＜0.01）；SKI组、ICG-001组较模型组划痕比例减小（0.2888±0.1205，0.6971±0.1929，比0.8756±0.0500，P值＜0.05）；SKI组划痕比例明显低于ICG-001组（P＜0.01）。免疫荧光显示模型组较空白组细胞ColⅠ、FN荧光信号增强；SKI组与ICG-001组相比模型组ColⅠ、FN荧光信号减弱。模型组相比空白组胞质α-SMA荧光信号增强，而胞膜E-cadherin荧光信号减弱；SKI组与ICG-001组相比模型组α-SMA荧光信号减弱，E-cadherin荧光信号增强。Westernblot蛋白半定量、RT-qPCRmRNA定量检测显示模型组较空白组ColⅠ、FN、α-SMA表达明显增加（P＜0.01），E-cadherin表达明显下降（P＜0.01）；SKI组、ICG-001组相比模型组ColⅠ、FN、α-SMA表达明下降（P＜0.01），E-cadherin表达则增加（P＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　1.网络药理学分析提示肾康注射液具有多种活性成分，可通过多靶点、多信号通路改善肾纤维化，其中Wnt信号通路是预测所得重要信号通路。<br>　　2.肾康注射液可改善UUO大鼠一般情况，保护肾功能，减轻肾脏病理损害，改善肾间质纤维化；UUO大鼠Wnt/β-catenin信号通路被激活，肾康注射液可下调此信号通路主要参与因子表达水平。<br>　　3.TGF-β1刺激后HK-2细胞Wnt/β-catenin信号通路激活，细胞梭形改变、迁移明显；肾康注射液可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路抑制EMT，从而发挥抗肾纤维化的作用。