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摘要研究背景:<br>　　肥胖是一种因体内脂肪组织量过多和（或）脂肪组织与其它软组织的比例过高所导致能量代谢紊乱性疾病，全球患病率约为30％。肥胖引起的代谢紊乱是诱发2型糖尿病、脂肪肝、心脑血管疾病及多种癌症的重要危险因素，故肥胖被WHO列为导致疾病负担的十大危险因素之一。肥胖导致的能量代谢紊乱包括了糖代谢和脂代谢两个方面，与代谢性炎症、胰岛素抵抗关系密切。慢性炎症在肥胖的疾病演变进程中扮演着关键角色，减轻炎症反应是防治肥胖及其代谢性的并发症有效手段。前期研究我们发现黄连-吴茱萸（连萸）等比配伍具有降脂、抗炎的功效，但其作用机制尚不明确。为进一步探究黄连吴茱萸配伍改善肥胖小鼠糖脂代谢作用机制，本研究拟通过实验研究、文献研究、数据挖掘、网络药理学等方法对黄连吴茱萸配伍治疗肥胖的有效性及作用机制进行深入探索。<br>　　研究目的：<br>　　明确黄连吴茱萸等比配伍改善肥胖的糖脂代谢有效性，探索其是否能通过抑制巨噬细胞极化激活iNKT细胞分泌细胞因子发挥抗炎的作用。<br>　　研究方法：<br>　　1.文献数据挖掘：<br>　　搜索《中医方剂大辞典》中同时含有“吴茱萸”“黄连”的方剂，根据中医传承辅助平台V3.0系统要求的Excel数据表格模板要求建立方剂数据库，中医传承辅助平台进行相关统计与关联规则分析、R语言对药物-中医主治疾病进行分组聚类分析，挖掘黄连-吴茱萸配伍用药规律及主治疾病。<br>　　2.网络药理学及分子对接：<br>　　使用黄连、吴茱萸中的7个主要成分从TCMSP数据库得到药物成分靶点，从在Genecards数据库中以“obesity”和“glucoseandlipidmetabolism”为关键词，检索肥胖和糖脂代谢相应靶点，取交集为肥胖糖脂代谢的靶点，再将将药物靶点与疾病靶点取交集得到的“药物-疾病”靶点，使用DAVID数据库进行通路GO和KEGG富集分析。将CD1d、IL-10进行分子对接，通过ChemDraw15对配体小分子进行优化处理，用AutoDockVina进行对接，在每个分子产生的构象中选择结合能最大的结果进行分析，利用PyMol和DiscoveryStudio对结果进行可视化。<br>　　3.实验研究：<br>　　通过高脂饲料喂养小鼠12周，建立高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型。按照空白组小鼠平均体重的1.2倍筛选出成功建立高脂饮食诱导肥胖模型小鼠后，随机分为5个组，分别为模型组（HLD，n=8）、黄连组(HL，n=6)、吴茱萸(WZY，n=8)、连萸组(HW，n=8)、西药组(ATO，n=8）。分组后，空白组和模型组用生理盐水灌胃，其余4组给予相应干预药物，持续6周。干预周后，对各组小鼠一般情况、脂代谢、糖代谢、肝脏病理情况进行观察，验证黄连吴茱萸配伍对饮食诱导的肥胖小鼠糖脂代谢的改善作用，测血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α炎症因子水平观察其抗炎作用；观察脂肪组织中CD1d蛋白表达，肝脏组织、脂肪组织中CD1d、IFN-γ、IL-6基因表达水平，检测肝脏组织中CD1d、IFN-γ蛋白含量情况，流式细胞检测观察肝脏中巨噬极化、各免疫细胞表面CD1d蛋白表达，探索黄连吴茱萸配伍对饮食诱导的肥胖小鼠肝脏组织巨噬细胞极化调控iNKT细胞激活机制。<br>　　研究结果：<br>　　1.文献数据挖掘：<br>　　通过数据分析，在方剂大辞典中有《中医方剂大辞典》中搜索出174首含黄连、吴茱萸的方剂，涉及241味药材,其中以黄连、吴茱萸等比配伍的方剂占总方剂的一半以上（58.04%），按四气五味以温寒、辛苦为主，按归经主要为脾胃肝；含黄连吴茱萸配伍的方剂其主治主要为脾胃系疾病，主要包括痢疾、泄泻、腹痛、呕吐、腹胀等气机升降失常、寒热错杂的疾病，还有嘈杂吐酸、吐酸、肝火犯胃、胃脘痛、呃逆、胁痛等肝胃不和之证。<br>　　2.网络药理学及分子对接：<br>　　黄连吴茱萸7个有效成分共筛选出68个靶点，筛选出肥胖和糖脂代谢相应靶点5546个，与药物之间共同的靶点58个，关键靶点主要参与95个通路，排除肿瘤、肝炎等其它与肥胖不相关通路通路，最终得到肥胖糖脂代谢相关通路18条。分子对接结果表明：黄连、吴茱萸7个成分中与IL-10和CD1d具有较好的结合能，药物分子与蛋白周围氨基酸残基形成氢键、C-H键、π-π键、疏水作用等分子间相互作用力。<br>　　3.实验研究：<br>　　（1）高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型的建立<br>　　60只C57BL/6小鼠适应性喂养1周后，随机分空白组（n=12）,模型组（n=48）。在喂养12周后，用对照饲料喂养空白组小鼠平均体重均为30g，按照空白组小鼠平均体重的1.2倍36g，模型组48只中有40只小鼠达到36g。成功建立高脂饮食诱导肥胖的模型组小鼠体重、血清TC、LDL-C、HDL-C、Glu-G均明显高于空白组。<br>　　（2）黄连吴茱萸配伍对高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂代谢的影响<br>　　在6周的干预治疗后，黄连组、连萸组、西药组体重均明显低于模型组（P＜0.01），其中黄连组小鼠体重减少最多且与空白组相比无统计学差异。与空白组相比，高脂饮食诱导后小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，各治疗组小鼠血清TC含量均有所降低，西药组小鼠血清TG含量有所降低，连萸组小鼠血清含量LDL-C有所降低(P＜0.01)，各治疗组血清HDL-C含量变化无统计学差异。高脂诱导后模型组小鼠体脂率较空白组明显身高(P＜0.01)；与模型组相比，黄连组、连萸组较模型组有所降低（P＜0.05或P＜0.01），吴茱萸组、西药组无明显变化。干预6周后，对肝脏HE染色发现，各治疗组较模型组肝脏改善情况：连萸组gt;西药组gt;黄连组gt;吴茱萸；肝脏油红O染色显示各治疗组干预后脂滴减少，其中连萸组改善最为明显。<br>　　（3）黄连吴茱萸配伍对高脂饮食诱导的肥胖小鼠糖代谢的影响<br>　　在高脂饮食诱导小鼠肥胖后，小鼠空腹Glu-G水平、糖耐量及胰岛素耐量、血清胰岛素含量、胰岛素指数均明显升高。干预6周后，与模型组相比，连萸组、黄连组、西药组空腹Glu-G水平、糖耐量及胰岛素耐量明显降低或改善，其中空腹Glu-G水平疗效连萸组gt;黄连组gt;西药组，连萸组糖耐量略优于其他治疗组，吴茱萸组糖耐量略优于模型组但胰岛素耐量较模型组更差；连萸组、吴茱萸组、黄连组血清胰岛素水平均明显降低，疗效连萸组gt;吴茱萸组gt;黄连组；胰岛素指数方面，各组均明显降低，其中连萸组明显优于其余各组且较空白组无统计学差异。<br>　　（4）黄连吴茱萸配伍对高脂饮食诱导的肥胖小鼠代谢性炎症的影响<br>　　通过MSD多因子检测发现，与空白组相比，模型组血清Th1型促炎性细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α显著升高（P＜0.01），血清Th2型抗炎性细胞因子IL-4、IL-10明显降低（P＜0.01）。6周干预治疗后，与模型组相比，各血清IFN-γ、IL-2、IL-6均明显降低（P＜0.01），其中且连萸组疗效优于其余治疗组；连萸组、吴茱萸组、西药组血清TNF-α均明显降低，而黄连组较模型组有所增加（Plt;0.01）；黄连组、连萸组血清IL-10均明显升高，而西药组较模型组血清IL-10有所降低（Plt;0.01）；仅有连萸组血清IL-4有所升高（Plt;0.01）。通过RT-PCR、Westernblot检测发现，造模后肝脏组织IFN-γ、IL-6mRNA表达水平、IFN-γ蛋白含量,脂肪组织中IFN-γmRNA表达水平明显升高（P＜0.01）。6周干预治疗后，与模型组相比，各治疗组IFN-γ、IL-6mRNA表达水平、IFN-γ蛋白含量均有所降低（P＜0.01）其中连萸组优于黄连组和吴茱萸组。<br>　　（5）黄连吴茱萸配伍对高脂饮食诱导的肥胖小鼠巨噬细胞极化及iNKT细胞的调控作用<br>　　通过免疫组织化学发现脂肪组织中CD1d蛋白变化，模型组小鼠出现大量棕黄色阳性表达，6周治疗干预后，黄连组、西药组棕黄色阳性表达较模型组明显减少，吴茱萸组、黄连组散在分布有棕黄阳性表达。通过RT-PCR、Westernblot检测发现，造模后肝脏组织、脂肪组织中CD1dmRNA表达水平明显升高（P＜0.01）；6周治疗干预后，黄连组、连萸组和西药CD1dmRNA表达水平均有所降低，其中连萸组CD1dmRNA表达水平最低；造模后肝脏组织CD1d蛋白含量表达水平明显升高（P＜0.01）；6周治疗干预后，各治疗组对肝脏组织CD1d蛋白含量影响均不明显。通过流式细胞检测发现，肝脏组织中巨噬细胞、DC细胞表面均有CD1d蛋白表达，DC细胞的占比明显多于巨噬细胞，但DC细胞表面的CD1d蛋白表达少于巨噬细胞表面的1/10。在模型组小鼠中M1型巨噬细胞比例较空白组有所增加，其表面CD1d蛋白表达较正常小鼠高；而模型组小鼠中M2型巨噬细胞比例有所降低，其表面CD1d蛋白含量较正常小鼠有所降低。干预6周后，连萸组小鼠肝脏组织中M1型巨噬细胞比例较模型组组有所减少，其表面CD1d蛋白含量较模型小鼠低；而连萸组小鼠中M2型巨噬细胞比例有所升高，其表面CD1d蛋白含量较模型小鼠有所升高。<br>　　结论：<br>　　1.黄连吴茱萸等比配伍辛开苦降、寒热并用，可调畅中焦气机，契合因气机升降失常膏脂转输不利所致的肥胖病机。<br>　　2.黄连吴茱萸等比配伍可以改善高脂饮食诱导肥胖小鼠体内的因胰岛素抵抗、代谢性炎症引起的糖脂代谢异常，且二药合用后作用优于单用。<br>　　3.黄连吴茱萸等比配伍可通过降低肝脏组织中M1型巨噬细胞比例并减弱其表面CD1d蛋白表达强度，同时升高肝脏组织中M2型巨噬细胞比例并增强其表面CD1d蛋白表达强度，调控下游iNKT细胞炎症因子的释放，进而减轻慢性炎症，这可能是其改善肥胖糖脂代谢作用机制之一。