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摘要背景<br>　　心绞痛（Anginapectoris,AP）是危害全球人类健康的重大疾病，指南推荐的干预措施并不能降低疾病进展和主要心血管不良事件的风险，目前的治疗方案存在巨大挑战。研究表明，心绞痛多具有穴位敏化现象，穴位敏化在心绞痛的诊断和治疗中具有重要作用，刺激敏化穴位治疗心绞痛疗效优于非敏化穴位。然而，心绞痛穴位敏化的机制尚不清楚。穴位敏化现象是脏腑-经穴相关的重要体现，其过程中涉及靶器官与经穴之间的信息交换和传递。外泌体是胞间通讯的重要载体，可以通过携带circRNA等生物活性物质实现器官与器官或组织间的信息传递，是目前组织细胞间远道调控作用的研究热点，为心绞痛穴位敏化机制研究提供了新思路。<br>　　目的<br>　　本研究以心绞痛大鼠为研究对象，检测：（1）心绞痛模型大鼠的经穴敏化特征；（2）心绞痛模型大鼠血浆外泌体差异表达的circRNA；（3）心绞痛模型大鼠敏化经穴皮肤局部差异表达的circRNA；（4）心绞痛模型大鼠血浆外泌体和敏化经穴皮肤共表达的特异性circRNA，进行基因本体论（Geneontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG）通路分析，预测其可能涉及的生物学功能和信号通路。通过对不同circRNA的靶向microRNA进行预测和分析，构建circRNA-microRNA-mRNA调控网络，揭示外泌体circRNA在心绞痛经穴敏化过程中潜在的分子机制。为进一步研究穴位敏化理论的科学内涵提供科学依据，为心绞痛的临床治疗和基础研究提供新的诊断标志物和研究通路。<br>　　方法<br>　　本研究以健康雄性SpecificpathogenFree（SPF）级SpragueDawley（SD）大鼠为实验动物，通过低剂量腹腔注射盐酸异丙肾上腺素（Isoprenaline,ISO）制备AP模型，研究分以下四部分进行：<br>　　实验一主要观察AP大鼠的经穴敏化特征：SPF级健康雄性SD大鼠18只，随机分为生理盐水对照组（Control,Cc,n=9）和心绞痛模型组（Treatment,Tc,n=9）。Tc组进行低剂量ISO腹腔注射制备AP模型，以标准II导联心电图、血清心肌缺血相关指标、心脏组织病理HE染色、心脏组织炎症因子ELISA检测判断心肌缺血损伤，斜方肌肌电信号评估心脏痛反应，综合评价心绞痛模型。以大鼠双侧内关穴为特异性经穴，少海穴为本经穴，尺泽穴为他经他穴，以及臀部一点为非经非穴，采用ElectricVonFrey电子测痛仪（美国IITCLifeScience公司）对穴位进行机械压痛阈检测，对穴位皮肤及皮下结缔组织进行甲苯胺蓝染色观察肥大细胞及脱颗粒变化，研究AP模型大鼠的经穴敏化特征。<br>　　实验二主要检测AP模型大鼠血浆外泌体携带的circRNA的差异性表达谱：SPF级健康雄性SD大鼠6只，Cc组3只，Tc组3只，腹主动脉采血离心提取血浆，超速离心收集外泌体并进行外泌体鉴定，提取外泌体RNA，质检合格后上机进行外泌体circRNA芯片测序，探索AP疾病模型大鼠血浆外泌体差异表达的特异性circRNA，揭示外泌体circRNA可能参与心绞痛病理过程。<br>　　实验三主要检测AP模型大鼠敏化经穴皮肤局部circRNA的差异性表达：SPF级健康雄性SD大鼠6只，Cc组3只，Tc组3只，选取Tc组和Cc组大鼠左内关穴位局部皮肤组织，提取穴位皮肤组织RNA，质检合格后上机进行高通量测序，探索AP疾病模型敏化经穴皮肤差异表达的特异性circRNA，揭示穴位局部circRNA可能参与穴位敏化过程。<br>　　实验四主要探索AP模型大鼠经穴敏化发生的外泌体circRNA分子机制：根据实验二和实验三测序结果，查找血浆外泌体和敏化经穴皮肤共表达的差异circRNA，进行实时定量基因扩增荧光检测（Real-timeQuantitativePolymeraseChainReactionDetecting,qPCR）验证和circRNA环形结构验证，对两种组织共表达的差异性circRNA进行GO富集和KEGGPathway分析，预测其可能涉及的生物学功能和信号通路。通过对差异表达circRNA的靶向microRNA进行预测和分析，构建circRNA-microRNA-mRNA调控网络，揭示潜在的外泌体circRNA在心绞痛模型大鼠经穴敏化过程中的分子机制。<br>　　结果<br>　　1.心绞痛模型大鼠的经穴敏化特征<br>　　本研究通过连续低剂量腹腔注射ISO制备心绞痛模型，造模后心绞痛模型大鼠心电图、斜方肌肌电信号异常，血清心肌缺血相关指标（LDH、CK、CK-MB、Mb、cTn-T、cTn-I）和心脏炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）明显高于生理盐水对照组，心脏病理切片明显异常，表明本研究心绞痛模型制备成功。Tc组大鼠双侧内关穴机械痛阈值变化率明显高于Cc组和Tc组内其他穴位，双侧内关穴肥大细胞脱颗粒率明显高于Cc组，表明心绞痛模型大鼠双侧内关穴发生穴位敏化现象，内关穴是心绞痛大鼠的特异性敏化经穴。<br>　　2.心绞痛模型大鼠血浆外泌体circRNA差异表达谱<br>　　血浆外泌体circRNA芯片共检测到了7484条circRNA，以foldchange≥1.2，显著性p-valuelt;0.05进行筛选，105个circRNA符合筛选标准，其中84个在Tc组中高表达，21个在Tc组中低表达。血浆外泌体差异表达105个circRNA靶向预测298个microRNA，其中29个microRNA与心肌缺血相关。靶向预测了15013个mRNA，其中236个mRNA与心肌缺血相关。结合既往研究和circRNA的“海绵”吸附效应，circRNA_011451/miR-138-5p/EGR1,circRNA_011602/miR-181d-5p/EGR1,circRNA_011602/miR-181a-5p/JAK2/STAT3,circRNA_013371/miR-183-5p/VDAC1,circRNA_013500/miR-21-5p/PDCD4,circRNA_011304/miR-342-5p/GPRC5A,circRNA_015205/miR-378a-3p/TRIM55/DUSP1/JNK,circRNA_009165/miR-451-3p/MAP1LC3B网络可能通过调节心肌细胞自噬和细胞凋亡机制参与心绞痛过程。<br>　　3.心绞痛模型大鼠敏化经穴circRNA差异表达谱<br>　　敏化经穴内关穴局部皮肤组织circRNA高通量测序共检测到了4897条circRNA，以foldchange≥1，显著性p-valuelt;0.05进行筛选，83个circRNA符合筛选标准，其中33个在Tc组中高表达，50个在Tc组中低表达。皮肤差异表达83个circRNA靶向预测752个microRNA，其中62个microRNA与心肌缺血相关。靶向预测了15356个mRNA，其中110个mRNA与肥大细胞功能相关。3个差异表达的circRNA（circ_008446,circ_011053,circ_017344）同时靶向6个microRNA（miR-135a-5p,miR-146a-3p,miR-200a-3p,miR-335,miR-542-3p,miR-873-5p），并靶向预测多个同时参与肥大细胞脱颗粒和心肌缺血的病理过程mRNA（JAK2,Rcan1,STIM1,Egr1,Sirt4,TLR4,HMGB1），以上基因形成的circRNA-microRNA-mRNA网络可能通过影响肥大细胞脱颗粒功能参与心绞痛模型大鼠经穴敏化过程。<br>　　4.外泌体circRNA参与调控心绞痛模型大鼠经穴敏化的机制<br>　　血浆外泌体和敏化经穴皮肤组织circRNA差异表达存在一致性，circRNA_000531（外泌体）与circRNA_006599（皮肤）为同一基因，同时在心绞痛模型大鼠血浆外泌体和敏化经穴皮肤组织中高表达。circRNA_005849（外泌体）与circRNA_023153（皮肤）为同一基因，同时在心绞痛模型大鼠血浆外泌体和敏化经穴皮肤组织中低表达。RT-qPCR验证表明血浆外泌体circRNA芯片测序和敏化经穴皮肤circRNA高通量测序结果可靠，circ_006599和circ_023153符合环形结构。circ_006599和circ_023153靶向预测38个microRNA，10489个mRNA。其中，7个microRNA（miR-132-5p,miR-133b-5p,miR-200a-5pmiR-431,miR-212-3p,miR-130a-3p,miR-132-3p）与心肌缺血相关，278个mRNA与心肌缺血相关，13个mRNA（Aldh2,Hdc,Hmgb1,Kdm2b,Lamp2,Nlrp3,Nod2,Pld1,Egr1,Jak2,Rcan1,Sirt4,Stim1）同时与心肌缺血和肥大细胞脱颗粒相关。心绞痛模型大鼠血浆外泌体circRNA_000531可能通过血液循环与经穴皮肤circ_006599共同高表达调节下游信号分子miR-132-3p和Hmgb1，影响特异性经穴局部肥大细胞脱颗粒功能诱导穴位敏化现象发生。<br>　　结论<br>　　1.心绞痛模型大鼠双侧内关穴发生穴位敏化现象，内关穴是心绞痛模型大鼠的特异性敏化经穴。<br>　　2.血浆外泌体和穴位皮肤circRNA在心绞痛模型大鼠经穴敏化过程中出现差异表达。<br>　　3.circRNA_000531（外泌体）/circRNA_006599（皮肤）/miR-132-3p/Hmgb1网络可能是血浆外泌体circRNA参与心绞痛模型大鼠经穴敏化过程的分子机制。