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摘要本文开展了以下三个部分的研究：<br>　　一、日本血吸虫特异性小分子DNA片段荧光定量PCR（qPCR）检测方法的建立<br>　　目的：对SjG28、SjR2、COI、nad1四种日本血吸虫基因进行筛选，确定最适靶基因，以建立日本血吸虫小分子DNA片段的荧光定量PCR检测方法。<br>　　方法：选取SjG28、SjR2、COI、nad1等4种基因片段作为待扩增靶序列，通过PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳方法，对以上4种基因及其对应引物进行筛选，确定检测靶基因。基于Taqman探针的原理设计81 bp的引物及探针，建立日本血吸虫小分子片段的qPCR检测方法；以日本血吸虫基因组DNA、合成的小分子DNA片段为模板进行扩增，评价该方法的敏感性；以日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、田鼠巴贝西虫、卫氏并殖吸虫、十二指肠钩口线虫、华支睾吸虫基因组DNA为模板进行检测，评价该方法的特异性。<br>　　结果：琼脂糖凝胶电泳显示，以SjG28、SjR2、COI基因为扩增靶基因的PCR法分别最低可检测出0.05ng/μL、0.1 ng/μL、0.5ng/μL的日本血吸虫基因组DNA ，以SjG28为靶基因的敏感性高于SjR2、COI基因；在日本血吸虫基因组低浓度模板DNA （0.5 ng/μL）时，SjG28基因的扩增条带清晰明亮，最终确定以SjG28为靶基因建立日本血吸虫qPCR检测方法。该方法最低能扩增约1 fg/μL的日本血吸虫基因组DNA，以合成的小分子DNA片段为模板，该方法最低能扩增到约100拷贝/μL的片段；以日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、田鼠巴贝西虫、卫氏并殖吸虫、十二指肠钩口线虫、华支睾吸虫基因组DNA为模板进行检测，仅日本血吸虫基因组DNA模板有荧光信号值增长。<br>　　结论：本部分筛选并确定日本血吸虫SjG28片段为扩增靶基因，并根据尿液中DNA多为小分子片段的特点，设计引物探针建立了日本血吸虫小分子DNA片段的qPCR检测方法，该方法特异性好、灵敏度较高，为下一步评价尿液中小分子DNA片段提取方法的效果提供了一种技术方法。<br>　　二、尿液中外源日本血吸虫小分子DNA片段提取方法的建立与评价<br>　　目的：采用不同处理方式提取尿液中外源日本血吸虫81 bp小分子DNA片段，以建立一种可有效提取尿液中日本血吸虫小分子DNA片段的方法。<br>　　方法：以日本血吸虫SjG28基因为靶序列进行PCR扩增，制备81bp的外源日本血吸虫小分子DNA片段。将初始浓度为109拷贝/μL的81 bp外源日本血吸虫小分子DNA片段稀释至1.0 × 108、1.0 × 107、1.0 × 106、1.0 × 105、1.0 × 104、1.0 × 103、1.0 × 102拷贝/μL，各取2μL上述核酸作为模板进行qPCR扩增，重复检测3次，每次设三个复孔，对样本Ct值与浓度的对数值进行线性回归分析，建立标准曲线。<br>　　将81 bp外源小分子DNA片段添加至人工尿液、健康人尿液、未感染家兔尿液后，经调整pH值、离心、浓缩等处理后，采用QIAmp Viral RNA mini kit试剂盒（Qiagen试剂盒）、BIOG cfDNA easy kit试剂盒（BIOG试剂盒）提取尿液中的外源小分子DNA片段。根据待测样本的Ct值，从标准曲线方程中计算得出样本的起始拷贝数，据此计算并比较尿液样本中核酸经不同处理方式及提取方法的效果。<br>　　结果：当外源小分子DNA片段浓度范围在1.0 × 108、1.0 × 107、1.0 × 106、1.0 × 105、1.0 × 104、1.0 × 103、1.0 × 102拷贝/μL时，其Ct值分别为10.37、13.95、16.34、19.75、22.58、24.57、27.85，且Ct值与拷贝数的对数成线性关系（y=-0.382 x+11.689,R2=0.994）。<br>　　当人工尿液pH值为5、6、7、8，采用Qiagen试剂盒提取其中的外源日本血吸虫小分子DNA片段回收率分别（49.12±2.09）%、（84.52±4.96）%、（89.38±3.32）%和（ 87.82±3.90 ）%；采用 BIOG 试剂盒提取小分子 DNA 片段回收率分别为（2.30±0.07）%、（8.11±0.26）%、（13.35±0.61）%、（20.82±0.68）%，两种方法提取回收率差异均有统计学意义（t=38.702、26.955、39.042、29.571，P均lt;0.01）。采用Qiagen试剂盒提取人工尿液，pH值为5时核酸回收率最低（P均lt;0.05）；pH值为6、7、8时，核酸回收率差异均无统计学意义（P均gt;0.05）。<br>　　人工尿液中添加外源小分子DNA片段经离心处理后，其回收率为(58.87±0.26)%，较未经离心的回收率(64.30±1.00)%降低（ t=12.033, P＜0.05 ）；添加有外源小分子DNA片段的人工尿液样本未经浓缩以及分别经100 k、10 k浓缩管浓缩处理后提取核酸，测得Ct值分别为15.19 ± 0.60、15.33 ± 0.40、10.82 ± 0.27，采用10k浓缩管处理后核酸提取效果差异显著（t=25.355，P＜0.01）。<br>　　健康人尿液未离心、离心后外源小分子DNA片段的浓度分别约为（31 165±1 017）拷贝/μL、（ 28 471±818 ）拷贝/μL ，离心后外源小分子DNA片段回收效果降低（ t=23.164，P＜0.05）；未浓缩、使用100K离心浓缩管、使用10K离心浓缩管，健康人尿液中可检测到的外源小分子DNA片段的浓度分别为（ 7 126±497 ）拷贝/μL、（ 27 067±1 461）拷贝/μL、（688±118）拷贝/μL，使用100 k浓缩管浓缩能有效提高健康人尿液中外源小分子DNA片段的回收效果（t=-33.508，P＜0.01）。<br>　　未感染家兔尿液未离心、离心后外源小分子片段的浓度分别为（ 191.47±3.04 ）、（110.62±5.51）拷贝/μL，离心后外源小分子DNA片段回收效果降低（t=22.257 ，P＜0.01）；未经浓缩、使用100K离心浓缩管浓缩，可检测到外源小分子DNA片段的浓度分别约为（16.21±1.02）拷贝/μL、（193.04±3.94）拷贝/μL，使用100 k浓缩管浓缩能有效提高未感染家兔尿液中外源小分子DNA片段的回收效果（t=-75.344，P＜0.01）。<br>　　结论：本部分对尿液中外源小分子DNA片段的不同提取方法和效果进行了研究，使用Qiagen试剂盒、尿液样本pH值调整至6～8、使用100K浓缩管浓缩可显著提升健康人尿液、未感染家兔尿液中小分子DNA片段的提取效果。<br>　　三、日本血吸虫感染家兔尿液中特异性小分子DNA片段的检测<br>　　目的：对不同日本血吸虫感染时期的家兔尿液样本开展检测，评估前期构建的特异性小分子DNA片段检测方法应用于日本血吸虫感染宿主尿液样本检测的可行性。<br>　　方法：建立日本血吸虫感染家兔模型，收集感染前，感染后不同时间（3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周）尿液样本，采用第二部分建立的方法，对日本血吸虫感染家兔尿液进行检测，调整尿液pH值至7左右， 1500 g离心10 min ，使用Amicon ultra-15 mL 100 k浓缩管与Qiagen试剂盒，采用第一部分建立的日本血吸虫小分子DNA片段检测的qPCR法，检测家兔尿液提取的核酸，重复三次实验，每次设三个复孔。<br>　　结果：感染后3天（d）、1周（w）、2周、3周（w）、4周（w）、5周（w）、6周（w）的Ct值平均值分别为36.48、34.14、33.36、34.25、31.51、38.31、37.03，Ct值＜35判定为阳性，感染前家兔尿液血吸虫特异性核酸未检出。感染后1周至感染后4周，Ct值呈降低的变化趋势，提示尿液中cfDNA含量在家兔感染日本血吸虫的早期随时间延长逐渐增多。<br>　　结论：本部分将建立的日本血吸虫小分子DNA片段的qPCR检测方法和尿液中小分子DNA片段的提取方法应用于日本血吸虫感染家兔尿液的检测，在感染后1w、2w、3w、4w的样本中可检测到日本血吸虫小分子DNA片段。<br>　　总之，本研究以SjG28基因为靶序列建立了日本血吸虫特异性小分子DNA片段的实时荧光定量PCR检测方法，优化并建立了尿液中日本血吸虫小分子DNA片段的提取方法，将尿液样本pH值调整至6～8，经100K离心浓缩管处理，使用QIAmp Viral RNA Mini Kit试剂盒（Qiagen试剂盒）可提高尿液中小分子DNA片段的提取效果。采用本研究建立的尿液中日本血吸虫小分子DNA片段提取方法与qPCR检测方法，检测家兔感染日本血吸虫后不同时间的尿液样本，结果显示感染后1周至4周采用qPCR检测尿液中日本血吸虫小分子DNA片段含量增加。基于尿液样本的日本血吸虫特异性基因片段的检测方法，有望为血吸虫病的快速精确诊断提供一种新的手段。