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摘要目的：<br>　　在离体支气管环开展麻黄-杏仁药对及麻杏石甘汤的药效学研究与评价，论证含药肝孵育液法用于中药体外组织器官水平药理学研究的可行性；在此基础上，以含药肝孵育液法为桥梁，开展麻黄-杏仁药对体外组织器官水平的整合PK-PD结合模型研究，初步探讨药对与机体之间的相互作用及其规律，为中药PK-PD结合模型研究提供新的思路与方法。<br>　　方法：<br>　　1.含药肝孵育液法用于中药体外组织器官水平研究可行性验证<br>　　1.1麻黄-杏仁药对舒张支气管平滑肌药效学研究<br>　　采用HPLC法测定不同配比（8:1、2:1、1:2）麻黄-杏仁药对含药肝孵育液中麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、苦杏仁苷的含量；以不同配比麻黄-杏仁药对含药肝孵育液为对象，采用2%乙酰胆碱和0.4%磷酸组胺诱导离体气管环建立体外支气管平滑肌痉挛/损伤模型，采用生物信号采集分析系统检测离体气管环张力变化，ELISA检测离体气管cAMP与cGMP及二者比值水平；以主要有效成分群麻黄碱（X1）、伪麻黄碱（X2）、甲基麻黄碱（X3）、苦杏仁苷（X4）的含量为自变量，各效应指标气管环舒张率（Y1）、cAMP水平（Y2）、cAMP/cGMP比值（Y3）为因变量，采用多元线性回归分析两者之间的相关性。采用分子对接方法验证上述实验分析结果；在体外细胞水平建立ASMC细胞平滑肌痉挛/损伤模型，ELISA检测ASMC细胞cAMP与cGMP及二者比值水平；实验结果与上述支气管环实验结果结合分析。<br>　　1.2麻杏石甘汤抗气道上皮损伤初步机理研究<br>　　以不同配比麻杏石甘汤含药肝孵育液为对象，采用2%乙酰胆碱和0.4%磷酸组胺诱导离体气管环建立体外支气管平滑肌痉挛/损伤模型，采用生物信号采集分析系统检测离体气管环张力变化，ELISA检测离体气管GM-CSF、VEGF和EGFR水平，原位杂交和免疫组化分别检测离体气管PI3K mRNA和蛋白表达；实验结果与课题组前期整体动物水平和细胞水平药效学结果结合分析。<br>　　2.基于含药肝孵育液法的麻黄-杏仁药对整合PK-PD结合模型体外研究<br>　　2.1建立能够同时定量麻黄-杏仁药对中麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、苦杏仁苷等主要有效成分群的UPLC-MS/MS分析方法，并进行方法学验证。建立体外肠吸收模型，采用液质联用分别检测2.5、5、10、20、40、80、160min的肠吸收液中主要有效成分群的含量变化。建立体外肝细胞代谢模型，采用液质联用分别检测5、20、60、80、160、320、640min的肝孵育液中主要有效成分群的含量变化。不同时间点各有效成分含量变化经主成分分析法获得其整合FPK变化。<br>　　2.2以不同浓度（100%、85%、70%、55%、40%、25%、10%）麻黄-杏仁药对含药肝孵育液为对象，采用2%乙酰胆碱和0.4%磷酸组胺诱导离体气管环建立体外支气管平滑肌痉挛/损伤模型，采用生物信号采集分析系统检测离体气管环张力变化，ELISA检测离体气管cAMP与cGMP及二者比值水平。不同浓度下各效应指标经主成分分析法获得其整合FPD变化。<br>　　2.3分别以离体气管环舒张率、cAMP水平、cAMP/cGMP比值及整合药效学为PD指标，整合药动学为PK指标，以AIC、BIC为主要判别原则，通过WinNonlin8.2软件进行PK-PD结合模型拟合，并比较整合FPK与单一PD和整合FPD之间结合模型相关参数。<br>　　结果：<br>　　1.含药肝孵育液法用于中药体外组织器官水平研究可行性验证<br>　　1.1麻黄-杏仁药对舒张支气管平滑肌药效学研究<br>　　建立含药肝孵育液多成分的HPLC分析方法，方法学考察结果表明，线性、精密性、重复性和稳定性均较好。离体组织器官水平实验结果表明，各给药组均能舒张平滑肌，提高气管环舒张率（Plt;0.01），最佳配比为8:1；ELISA结果表明，与正常组比较，模型组cAMP水平、cAMP/cGMP比值下降（Plt;0.01），cGMP水平上升（Plt;0.01），与模型组比较，各给药组均能上调cAMP水平及cAMP/c GMP比值（Plt;0.05），对cGMP含量变化无显著影响，最佳配比为8:1；相关性分析结果表明，Y1=0.238X1-0.105X2+0.675X3-0.097X4-82.161（R2=0.961），Y2=0.068X1-0.005X2+0.080X3+0.004X4-1.745（R2=0.999），Y3=0.093X1-0.056X2+0.108X3+0.017X4-16.197（R2=0.999）；效应成分与效应指标之间相关性较强，效应成分对效应指标的影响强度为：甲基麻黄碱＞麻黄碱＞伪麻黄碱＞苦杏仁苷。<br>　　分子对接结果表明，效应成分与ADRB2结合活性强度为甲基麻黄碱＞麻黄碱＞伪麻黄碱＞苦杏仁苷；细胞水平实验结果表明，与正常组比较，模型组cAMP水平、cAMP/cGMP比值下降（Plt;0.01），cGMP水平上升（Plt;0.01），与模型组比较，各给药组均能上调cAMP水平及cAMP/cGMP比值（Plt;0.05），对cGMP含量变化无显著影响。分子对接结果和细胞水平实验结果与离体组织器官水平实验结果均一致。<br>　　1.2麻杏石甘汤抗气道上皮损伤初步机理研究<br>　　离体组织器官水平实验结果表明，各给药组均能舒张平滑肌，提高气管环舒张率（Plt;0.01）；ELISA结果表明，与正常组相比，模型组EGFR、VEGF、GM-CSF水平升高（Plt;0.01），与模型组相比，给药组VEGF、EGFR、GM-CSF水平降低（Plt;0.05）；原位杂交结果表明，与正常组相比，模型组PI3K mRNA表达升高（Plt;0.01），与模型组相比，给药组PI3K mRNA表达降低；免疫组化结果表明，与正常组相比，模型组PI3K蛋白表达升高（Plt;0.01），与模型组相比，给药组PI3K蛋白表达降低。对比分析发现上述实验结果与课题组前期整体动物水平和体外细胞水平药效学结果趋势较一致。<br>　　2.基于含药肝孵育液法的麻黄-杏仁药对整合PK-PD结合模型体外研究<br>　　2.1建立含药肝孵育液多成分同时定量的UPLC-MS/MS分析方法，方法学考察结果表明，线性、精密性、重复性和稳定性均较好，由于麻黄碱和伪麻黄碱属于同分异构体，有着相似的质谱信息，故分离度不佳，故把二者作为一个整体进行含量分析。离体肠吸收动力学研究结果表明，随着时间的增加，通过肠壁的主要有效成分的含量越多，且吸收速率加快，并且在160min内无吸收饱和的现象，其整合吸收动力学方程为：FPK=8·10-5t2+0.0141t+0.1502。肝细胞代谢动力学研究结果表明，随着时间的增加，通过肝细胞代谢的主要有效成分的含量减少，且代谢速率减慢，并且在320min后代谢速率趋于平缓，其整合代谢动力学方程为：FPK=1.29e-1.67t+3.47e-0.003t。<br>　　2.2离体组织器官水平实验结果表明，高浓度给药组（100%、85%、70%、55%、40%）能舒张平滑肌，提高气管环舒张率（Plt;0.01），且具有浓度依赖性，存在量效关系；ELISA结果表明，与正常组相比，模型组cGMP水平上升（Plt;0.01），cAMP水平、cAMP/cGMP比值下降（Plt;0.05），与模型组相比，高浓度给药组（100%、85%、70%、55%、40%）能上调cAMP水平和cAMP/cGMP比值（Plt;0.05），且具有浓度依赖性，存在量效关系，各给药组对cGMP含量变化无显著影响。主成分分析结果表明，整合药效学变化也具有浓度依赖性，存在量效关系。<br>　　2.3因肝细胞代谢能力限制，导致有效成分代谢不完全，故通过计算机模拟代谢二级速率过程并计算其整合代谢曲线得FPK=1.29e-1.67t+3.47e-0.003t，明确各给药浓度所对应的时间点。<br>　　结论：<br>　　1.麻黄-杏仁药对及其复方麻杏石甘汤在离体气管环的药效学实验结果均得到了其他方面结果的论证，初步表明含药肝孵育液法用于中药体外组织器官水平研究具备较强的可行性。<br>　　2.通过含药肝孵育法构建了体外整合PK-PD模型，且整合后模型拟合情况较佳，能较好的阐明“浓度-时间-效应”三者之间的关系，可为中药PK-PD结合模型研究提供了新的思路和方法。<br>　　3.以麻黄-杏仁药对为主的麻杏石甘汤平喘可通过激动支气管平滑肌细胞β2受体，升高cAMP含量、cAMP/cGMP比值而解除气道痉挛，并可能与调节PI3K信号通路和抑制气道重塑等机制有关。