摘要研究目的:<br> 骨质疏松是一种常见的全身性骨代谢疾病,其特征是骨矿物质密度和骨量下降以及骨微结构受损,从而导致骨脆性和骨折易感性增加。尽管有多种因素导致骨质疏松的发展,但激素缺乏和衰老起着关键作用。老年性骨质疏松被定义为与年龄相关的骨量丢失或骨骼系统中的结构受损。除了成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收之间的不平衡外,骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSC)的数量和功能变化也是老年性骨质疏松的关键原因之一。BMSC能够分化为成骨细胞(OB,osteoblast),软骨细胞和脂肪细胞,但在老年时,BMSC向OB的分化相对减少,向脂肪细胞分化相对增加,这种分化方向的转变导致骨形成减少,从而导致老年性骨质疏松。越来越多的证据表明适宜的运动能够促进骨形成,改善骨量,防治骨质疏松。运动能够增加BMSC的数量,增强其成骨分化潜能,并抑制其成脂分化,从而促进骨形成。相反,缺乏运动则会导致骨量的快速流失,这与BMSC的脂肪分化增强有关。但运动防治骨质疏松的机制目前尚未完全明确。近年来研究发现沉默信息调节因子1(Silentinformationregulator1,SIRT1)和自噬均能调节BMSC的谱系分化,在骨形成中发挥着重要的作用。但运动/机械应力是否可通过激活SIRT1促进BMSC自噬及其成骨分化,尚未见相关报道。因此本研究将以运动/机械应力—SIRT1—自噬—BMSC为主线,探究运动/机械应力是否可通过调控SIRT1表达影响BMSC的自噬水平及其成骨分化能力,为进一步探究运动防治骨质疏松的作用机制提供理论依据。<br> 研究方法:<br> 1动物实验部分<br> 将12月龄雄性C57BL/6小鼠随机分为老年对照组(S组)和老年运动组(E组),5月龄雄性C57BL/6小鼠作为年轻对照组(Y组),每组各10只。Y组和S组静置饲养,不做任何干预。E组通过跑台运动进行干预。跑台运动方案:第1周:15m/min,20分钟;第2~8周:每周增加1.5m/min,每周增加5min。整个训练过程跑台坡度均为0°。共计8周,5天/周,1次/天,每周一至周五训练,休息2天。跑台运动训练结束后24h取材,取右侧股骨固定后用于micro-CT扫描重建分析、HE染色、免疫组织荧光。取左侧股骨提取总RNA检测SIRT1,自噬因子和成骨因子的表达,以观察运动对老年性骨质疏松小鼠的骨保护作用。2细胞实验部分<br> 将培养至第二代的BMSC接种于BioFlex六孔板中,待细胞汇合至70%,通过脂质转染技术低表达细胞内SIRT1:将培养液更换为不含血清、青霉素和链霉素的α-MEM基本培养基培养,同时将制备好的siRNA(siRNA-SIRT1、siRNA-NC)-lipofectamine3000转染复合物加入到对应孔中,轻摇混匀放至细胞培养箱,6-8h更换为成骨诱导分化培养基,将实验分组为阴性对照组(NC)、SIRT1低表达组(si-C)、阴性对照牵张组(NS)和SIRT1低表达牵张组(si-S),对NS组和si-S组的BMSC进行分别进行1天和7天的机械牵张应力干预,以观察机械刺激对BMSC的短时和长期效应。NC和si-C组静置培养。牵张干预采用4%的牵张强度,0.5Hz牵张频率,单次牵张4h,7天牵张组进行隔天牵张。每48h更换培养液。7天牵张干预结束后对细胞进行ALP染色,免疫荧光染色检测SIRT1、LC3和Runx2的蛋白表达,Real-timePCR检测BMSC中SIRT1、成骨因子及自噬因子mRNA表达情况;1天牵张干预结束后对细胞进行MDC染色以观察自噬小体的数量,并提取总蛋白和总RNA,WesternBlot检测BMSC中SIRT1和LC3的蛋白表达,Real-timePCR检测BMSC中SIRT1和自噬相关因子mRNA表达情况,以明确SIRT1在运动/机械应力促进成骨分化中的作用机制。<br> 研究结果:<br> 1动物实验部分<br> (1)micro-CT结果显示:与年轻对照组相比,老年对照组小鼠骨小梁体积百分比、骨小梁数量、骨小梁厚度均显著减少(P<0.01),骨小梁分离度显著增加(P<0.01);与老年对照组相比,老年运动组小鼠骨小梁体积百分比、骨小梁数量、骨小梁厚度均显著增加(P<0.05),骨小梁分离度显著减小(P<0.01)。<br> (2)HE染色结果显示:相对于年轻对照组,老年对照组小鼠干骺线下骨小梁数量和分布体积减少,骨小梁排列稀疏。与老年对照组相比,老年运动组小鼠骨髓腔中骨小梁数量和分布体积增多。表明运动能够改善老年小鼠骨形成,延缓老年性骨质疏松进程。<br> (3)免疫荧光结果显示:与年轻对照组相比,老年对照组小鼠股骨SIRT1,LC3,Runx2蛋白荧光强度降低,且荧光表达分布面积也减少;与老年对照组相比,老年运动组小鼠SIRT1,LC3,Runx2蛋白荧光强度升高,且荧光表达分布面积也增大,提示运动能够增加老年小鼠SIRT1、自噬及成骨标记物水平。<br> (4)PCR结果显示:与年轻对照组相比,老年对照组小鼠股骨中SIRT1、成骨相关因子Runx2,Osterix,ALP,OCN以及自噬相关因子Beclin-1,ATG14,LC3的mRNA表达均显著降低(P<0.01);与老年对照组相比,老年运动组小鼠股骨中SIRT1、成骨相关因子Runx2,Osterix,ALP,OCN以及自噬相关因子Beclin-1,ATG14,LC3的mRNA表达均显著提高(P<0.01-0.05)。<br> 2细胞实验部分<br> (1)BMSC7天牵张实验结果:与阴性对照组相比,低表达SIRT1组细胞的ALP活性明显降低,SIRT1,Runx2,ALP,Osterix,Beclin-1,ATG7的mRNA表达均显著降低(P<0.01-0.05),SIRT1、LC3和Runx2的蛋白荧光强度减弱,蛋白表达减少;与阴性对照组相比,阴性对照牵张组细胞的ALP活性明显升高,SIRT1,Runx2,ALP,Osterix,Beclin-1,ATG7的mRNA表达均显著升高(P<0.01-0.05),SIRT1,LC3和Runx2的蛋白荧光强度增强,蛋白表达增加;与阴性对照牵张组相比,低表达SIRT1牵张组细胞的ALP分泌显著减少,SIRT1,Runx2,ALP,Osterix,Beclin-1,ATG7均显著降低(P<0.01-0.05),SIRT1,LC3和Runx2的蛋白荧光强度明显降低;与低表达SIRT1组相比,低表达SIRT1牵张组细胞的ALP活性无明显升高,SIRT1,Runx2,ALP,Osterix,Beclin-1,ATG7均为显著差异,SIRT1,LC3和Runx2的蛋白荧光强度无明显差异。表明7天持续牵张能够促进BMSC成骨分化,而SIRT1低表达则逆转了机械牵张的促成骨效应,这可能是通过SIRT1介导的自噬通路来实现的。<br> (2)BMSC1天牵张实验结果:与阴性对照组相比,低表达SIRT1组细胞中SIRT1蛋白表达量显著减少(P<0.01),LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化率显著降低(P<0.01),SIRT1,Beclin-和ATG7的mRNA表达显著下降(P<0.01-0.05),自噬小体荧光明显减弱,荧光密度较低和自噬颗粒稀疏,提示细胞内酸性自噬泡数量减少;与阴性对照组相比,阴性对照牵张组细胞中SIRT1蛋白表达量显著增加(P<0.01),LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化率显著增高,SIRT1,Beclin-1和ATG7的mRNA表达显著升高(P<0.01-0.05),自噬小体荧光明显增强,荧光密度和自噬颗粒均明显增加,细胞内酸性自噬泡数量增多;相较于阴性对照牵张组,SIRT1低表达牵张组中SIRT1蛋白表达显著下降(P<0.001),LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化率显著减少(P<0.01),SIRT1,Beclin-1和ATG7的mRNA表达显著下调(P<0.01-0.05),自噬小体荧光显著减弱,荧光颗粒减少,表明细胞内酸性自噬泡数量减少。BMSC1天牵张实验进一步明确了SIRT1在机械牵张促进BMSC自噬中的作用。<br> 研究结论:<br> 1.运动能有效促进衰老骨质疏松小鼠下肢骨中SIRT1的表达,并增强自噬水平和骨形成,防治老年性骨质疏松。<br> 2.适宜的机械牵张应力刺激可以促进BMSC中SIRT1的表达并上调自噬因子和成骨因子的表达,而在BMSC中低表达SIRT1抑制BMSC的自噬水平及成骨分化能力。
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