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摘要背景：<br>　　尤文肉瘤是一种强侵袭性恶性肿瘤，发病率居儿童骨肿瘤第二位。目前尤文肉瘤的治疗仍依赖于多学科联合治疗，将高强度化疗与手术/放疗相结合，以控制疾病的原发病变和转移性病变。尽管局限性尤文肉瘤患者5年生存率已经达到70-80%，但转移及复发患者5年生存率仍不足30%。作为一种强侵袭性、高复发率的恶性肿瘤，急需寻找新的治疗靶点。<br>　　作为一种有明确致癌因素的肿瘤，尤文肉瘤的致癌因子EWS-FLI1融合基因以相分离的形式激活下游靶基因，导致广泛的表观遗传学重塑，并驱动大量代谢重编程过程。作为一种基因突变率较低的肿瘤，尤文肉瘤缺乏可行的替代治疗靶点。因此，其致癌融合蛋白驱动的遗传转录调节是尤文肉瘤靶向治疗的新方向。表观遗传与肿瘤代谢作为肿瘤中一对相互串扰、密不可分的重要特征近年来备受关注，或许是尤文肉瘤靶向治疗的新方向。研究表明脯氨酸代谢中的副代谢效应介导的大量脯氨酰羟基化在表观遗传修饰中扮演重要角色，而乙醛脱氢酶18成员A1（Aldehydedehydrogenase18familymemberA1，ALDH18A1）作为谷氨酸、精氨酸及脯氨酸代谢的关键酶，在尤文肉瘤进展中扮演的角色尚不清楚，有待研究。<br>　　本研究发现，ALDH18A1高表达是尤文肉瘤患者预后不良的独立预测因子；ALDH18A1可调控尤文肉瘤家族肿瘤细胞的自我更新、增殖和体内成瘤能力；ALDH18A1可能通过促进聚（ADP-核糖）聚合酶1（Poly(ADP-ribose)polymerase1，PARP1）表达进而调控EWS-FLI1下游靶基因表达，促进尤文肉瘤细胞的自我更新和增殖；ALDH18A1抑制剂YG1702可能是尤文肉瘤治疗的潜在候选小分子。<br>　　主要研究方法及结果：<br>　　1.利用基因表达数据库（Geneexpressionomnibus,GEO）中尤文肉瘤基因表达谱数据集（GSE17674），比较ALDH18A1在人尤文肉瘤组织和人正常肌肉组织中的表达情况。结果显示，ALDH18A1在尤文肉瘤组织中高表达（Tumormean（n=44）vs.Normalmean（n=18）:6.94vs.4.77,P=2.46×10-34）。<br>　　2.使用GEO数据集，通过Kaplan-Meier和Cox回归分析尤文肉瘤患者中ALDH18A1的预后判断意义。结果显示，ALDH18A1高表达可作为尤文肉瘤患者预后的预测标志。其中，GSE17674数据集：ALDH18A1低表达患者的生存时间（平均生存时间为67.11±48.05月，n=34）较ALDH18A1高表达患者的生存时间（平均生存时间为22.67±13.21月，n=10）显著延长（P=1.00×10-3）；GSE17679数据集：ALDH18A1低表达患者的生存时间（平均生存时间为65.87±47.07月，n=71）较ALDH18A1高表达患者的生存时间（平均生存时间为20.01±11.36月，n=17）显著延长（P=1.00×10-4）；在GSE17679中进行单因素和多因素回归分析显示ALDH18A1表达水平与尤文肉瘤患者预后相关（P=1.00×10-4），是独立预后预测因素（P=1.46×10-7，风险系数5.57，95%置信区间2.94-10.55）。<br>　　3.利用WGCNA(Weightedgeneco-expressionnetworkanalysis)算法在GSE17618数据集中寻找与ALDH18A1高表达密切相关基因集，并进行GO富集分析，筛选（筛选标准：FDRlt;0.25,Plt;0.05）通路的富集情况。结果显示，ALDH18A1高表达与细胞分裂和DNA复制等进程密切相关，其中细胞分裂（100个基因富集，P=2.33×10-37）、DNA复制（67个基因富集，P=1.13×10-33）。<br>　　4.ShRNA敲低ALDH18A1表达，Cellcountingkit-8(CCK-8)、平板克隆形成实验、成球实验及裸鼠皮下移植瘤实验，检测尤文肉瘤细胞增殖、自我更新及体内成瘤能力的变化。结果显示：<br>　　增殖能力受到显著抑制（CCK8增殖实验：A673细胞系：shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-1组，n=5，P=7.00×10-3；shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-2组，n=5，P=7.50×10-3；SK-N-MC细胞系：shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-1组，n=5，P=4.00×10-6；shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-2组，n=5，P=1.40×10-5）。<br>　　克隆形成能力受到显著抑制（平板克隆实验：A673细胞系：shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-1组，n=3，P=2.90×10-5；shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-2组，n=3，P=4.00×10-6；SK-N-MC细胞系：shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-1组，n=3，P=5.14×10-4；shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-2组，n=3，P=4.77×10-4）。<br>　　成球能力受到显著抑制（成球实验：A673细胞系：shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-1组，n=6，P=1.35×10-3；shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-2组，n=6，P=1.35×10-3；SK-N-MC细胞系：shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-1组，n=6，P=0.02；shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-2组，n=6，P=0.02）。<br>　　体内成瘤能力受到显著抑制（裸鼠皮下移植瘤实验：A673细胞系：shALDH18A1-NC组肿瘤平均体积为957.60±161.40mm3，shALDH18A1-1组肿瘤平均体积为355.20±101.60mm3，n=6，P=7.90×10-5；shALDH18A1-NC组肿瘤平均重量为0.99±0.23g，shALDH18A1-1组肿瘤平均重量为0.42±0.16g，n=6，P=5.37×10-4）。<br>　　5.ShRNA敲低ALDH18A1表达后，RT-qPCR检测EWS-FLI1下游靶基因表达水平的变化。结果显示，敲低ALDH18A1后，尤文肉瘤细胞EWS-FLI1下游靶基因表达显著下调：<br>　　A673细胞系：PARP1mRNA水平：shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-1组，n=3，P=2.18×10-5;shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-2组，n=3，P=5.56×10-5，EWS-FLI1下游靶基因如EZH2mRNA水平：shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-1组，n=3，P=7.89×10-3；shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-2组，n=3，P=7.92×10-3。<br>　　SK-N-MC细胞系：PARP1mRNA水平：shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-1组，n=3，P=9.03×10-4；shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-2组，n=3，P=1.58×10-3，EWS-FLI1下游靶基因如NR0B1mRNA水平：shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-1组，n=3，P=5.29×10-4；shALDH18A1-NC组vs.shALDH18A1-2组，n=3，P=3.70×10-3。<br>　　6.ShRNA敲低ALDH18A1表达，Mito-TrackerRed免疫荧光染色检测线粒体数量。结果显示，敲低ALDH18A1后，尤文肉瘤细胞的线粒体数量减少，（MitoTracker相对荧光强度：A673细胞系：shALDH18A1-NC组（n=25）vs.shALDH18A1-1组（n=25），P=3.00×10-4；shALDH18A1-NC组（n=25）vs.shALDH18A1-2组（n=25），P=3.00×10-4；SK-N-MC细胞系：shALDH18A1-NC组（n=39）vs.shALDH18A1-1组（n=36），P=8.00×10-3；shALDH18A1-NC组（n=39）vs.shALDH18A1-2组（n=60），P=5.59×10-11）<br>　　7.采用RcisTargetR包对GSE17679数据集、GSE63155数据集和GSE63156数据集中ALDH18A1高低表达患者的差异基因进行转录因子富集分析。结果显示，PARP1显著富集（NES值=4.47，AUC值=9.29×10-2）。在GSE17679数据集、GSE63155数据集和GSE63156数据集的合并后数据集中发现ALDH18A1与PARP1的表达呈正相关（R=0.44，P=8.00×10-9）。<br>　　8.通过CCK8实验检测细胞活力，确定ALDH18A1小分子抑制剂YG1702对尤文肉瘤细胞增殖的抑制效应；进一步通过平板克隆及成球实验，验证YG1702对尤文肉瘤细胞自我更新能力的抑制效应。结果显示：YG1702显著抑制尤文肉瘤细胞的体外增殖（A673细胞系：WT组vs.YG1702组，n=5，P=9.94×10-3；SK-N-MC细胞系：WT组vs.YG1702组，n=5，P=2.52×10-7）、克隆形成（A673细胞系：WT组vs.YG1702组，n=3，P=7.80×10-5；SK-N-MC细胞系：WT组vs.YG1702组，n=3，P=1.86×10-4）和成球能力（A673细胞系：WT组vs.YG1702组，n=6，P=0.03；SK-N-MC细胞系：WT组vs.YG1702组，n=6，P=6.96×10-4）。<br>　　9.YG1702处理尤文肉瘤细胞后，RT-qPCR检测PARP1及EWS-FLI1下游靶基因表达水平的变化。结果显示，YG1702处理后尤文肉瘤细胞PARP1及EWS-FLI1下游靶基因表达明显下调：<br>　　A673细胞系：PARP1mRNA水平：Control组vs.IC50组，n=3，P=2.04×10-2；Control组vs.IC90组，n=3，P=3.22×10-3，EWS-FLI1下游靶基因如EZH2mRNA水平：Control组vs.IC50组，n=3，P=4.47×10-6；Control组vs.IC90组，n=3，P=3.69×10-8。<br>　　SK-N-MC细胞系：PARP1mRNA水平：Control组vs.IC50组，n=3，P=5.00×10-6；Control组vs.IC90组，n=3，P=2.00×10-6，EWS-FLI1下游靶基因如EZH2mRNA水平：Control组vs.IC50组，n=3，P=3.00×10-6；Control组vs.IC90组，n=3，P=1.08×10-7）。<br>　　10.构建尤文肉瘤细胞（A673细胞系）裸鼠皮下移植瘤模型，YG1702腹腔注射给药后，观察裸鼠体重及肿瘤生长情况。结果显示，体内成瘤能力受到显著抑制（Control组肿瘤平均体积为883.90±209.80mm3，YG1702组肿瘤平均体积为387.10±72.90mm3，n=6，P=2.70×10-4；Control组肿瘤平均重量为0.99±0.27g，YG1702组肿瘤平均重量为0.28±0.04g，n=6，P=2.03×10-3）。<br>　　结论：<br>　　1.ALDH18A1在尤文肉瘤中高表达并与患者不良预后密切相关，提示ALDH18A1可能在尤文肉瘤进展中扮演重要角色。<br>　　2.敲低ALDH18A1后显著抑制尤文肉瘤细胞增殖、克隆形成、成球和异种动物成瘤能力。提示，ALDH18A1高表达与尤文肉瘤细胞自我更新、增殖和肿瘤起始能力相关。<br>　　3.敲低ALDH18A1后PARP1及EWS-FLI1下游靶基因表达下调，提示ALDH18A1可能通过破坏EWS-FLI1-PARP1正反馈环路而抑制尤文肉瘤细胞自我更新。<br>　　4.ALDH18A1的小分子抑制剂YG1702能显著降低尤文肉瘤体内、外自我更新和增殖能力，可作为尤文肉瘤治疗的候选小分子。