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摘要研究目标：<br>　　1. 探索中红外光对在体大脑皮层神经元的效应；<br>　　2. 探索中红外光对在体大脑皮层神经元效应的时空分布特征；<br>　　3. 探索中红外光对在体大脑皮层神经元的效应的机制；<br>　　4. 探索中红外光对听觉联合型学习的效应。<br>　　研究方法：<br>　　1.中红外光照射<br>　　本研究采用了量子级联中红外(MIR)激光器。该激光器包含 4 个模块，用于连续波长调谐，但在本研究中，我们将波长固定在5.6μm持续工作。中红外光通过内径为100μm、数值孔径(NA)为0.27的MIR光纤(IRF-Se-100)耦合。在本研究的所有实验中，光纤尖端的平均功率(在空气中测量)在以下配置下保持在 9 ± 0.5 mW 的稳定水平:脉冲持续时间300 ns，重复频率100 kHz (相当于占空比3%时300 mW的峰值功率)。这种MIR脉冲激光器最初是为研究红外光谱的目的而设计的，当我们在这项研究中使用它时，所有的参数都配置为在5.6 μm波长时最大的总平均输出功率(在光谱方面，激光器在该波长提供最大输出功率)。<br>　　2.可见光照射<br>　　作为c-Fos成像实验的对照，我们使用与MIR光纤相同几何形状的标准单波长可见光(VIS)激光器。激光模型分别为 MBL-III-473-50mW 和 MBL-III-594-100mW，工作波长分别为473 nm和594 nm。这些VIS激光器通过光纤传输，其参数与MIR相同(芯径100μm, NA=0.27)。调整光纤尖端的输出功率，并将照射时间设置为与MIR相同(9 mW, 20 s)。对于c-Fos免疫组化实验，我们发现使用两种不同可见光波长得到的结果没有显著差异，因此将这些数据汇总在一起。在温度测量中，我们只使用594 nm作为VIS光源。<br>　　3.免疫组织化学<br>　　在 c-Fos 实验中，小鼠首先在异氟烷(1.5%)下麻醉，而后进行固定头部，对小鼠开颅或磨薄颅骨，光纤尖端被置于大脑皮层或置于磨薄的完整颅骨之上。应用中红外照射20 s后继续保持小鼠麻醉状态90 min，等待c-Fos的表达。然后小鼠心脏灌注4%多聚甲醛(PFA)，取出脑组织后固定在含有15%蔗糖的4%多聚甲醛中，4℃冷藏一夜。用冷冻切片机进行冠状切片(厚度30 μm)。c-Fos免疫组化染色使用一抗: Anti-c-Fos (ABE457, Millipore兔多克隆抗体，Lot# 3221531, 1:500稀释)，二抗: Alexa Fluor 594山羊抗兔(A11012, Invitrogen, Lot# 2119134, 1:500稀释)。DAPI (4 ''，6-二胺基-2-苯林多，D9564, Sigma-Aldrich, 1:1000稀释)用于所有c-Fos阳性细胞计数实验的细胞核染色。在一组独立对照实验中，使用抗体Anti-NeuN (MAB377, Millipore，小鼠多克隆抗体，1:2000稀释)标记神经元，二抗Alexa Fluor 488驴抗小鼠 (a2202, Invitrogen, Lot# 1644644, 1:500稀释)。染色好的脑片固定在载玻片上，用盖破片盖好，并使用扫描共聚焦微型显微镜(TCS SP5, Leica)成像。同时显示c-Fos和DAPI的细胞被定义为c-Fos阳性细胞，仅显示DAPI的细胞被定义为c-Fos阴性细胞。在c-Fos和NeuN共标记的对照实验中，显示NeuN的细胞被定义为神经元。<br>　　4.皮层温度测量<br>　　我们使用 ADINSTRUMENT 采集系统(Powerlab 4/35)耦合到 t 型皮下热电偶(MT 29/5, Physitemp)执行组织温度测量操作。我们将小鼠用异氟烷(1.5%)全身麻醉，而后固定头部，并将MIR(或VIS)光纤置于皮质表面。脑表面浸泡ACSF溶液，循环，控制在37℃。通过精细的微操作器将热传感器从水平方向插入皮层，以调整传感器尖端的深度和横向位置。为了进行这些测量，开颅后的硬脑膜被移除，以暴露皮层组织，传感器可以从水平方向插入。<br>　　5.电生理细胞贴附式记录<br>　　对于活体皮层神经元的电生理细胞贴附式记录，我们使用了“阴影膜片钳”程序。使用 EPC10 放大器(HEKA Elektronik，德国)进行细胞电信号记录。玻璃电极填充正常ACSF(双光子显微镜下可见约10 μM OGB1-6K染料)，电极尖端电阻为5-8 MΩ。电极以~100 mbar的正压穿透硬脑膜，然后降低到~30 mbar，在双光子成像下获得良好的电极和神经元阴影图像。使用 Patchmaster 软件(HEKA Elektronik，德国)对原始信号进行10 kHz滤波，并在20 kHz采样。在一些实验(6个神经元)中，插入第二个玻璃电极(尖端电阻为5-8 MΩ)靠近记录的神经元，吹药河豚毒素(TTX, 10 μM)，在50 mbar的压力下注射10 s。<br>　　6.双光子成像<br>　　在急性双光子Ca2+成像实验中，我们暴露小鼠的右侧听觉皮层。使用异氟烷将小鼠麻醉，并在热板上(37.5°C)保持体温。局部注射利多卡因，2 min后去除听觉皮层上的皮肤和肌肉。用氰基丙烯酸酯胶(UHU)将定制的固定槽固定在颅骨上，然后进行开颅(~ 2 mm × 2 mm)(中心点:Bregma：?3.0 mm，旁开4.5 mm)。实际上这些立体定向坐标对应了比听觉皮层的更大区域，包括初级听觉皮层(Au1)、背侧和腹侧次级听觉皮层(AuD和AuV)以及邻近的部分颞联系皮层(TeA)。在开颅手术后，小鼠被转移到双光子成像装置上，并头部固定，同时打开加热板保持小鼠体温恒定。灌流人工脑脊液(ACSF)，其中含有125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2和20 mM葡萄糖，含95%O2和5%CO2时pH为7.4。Ca2+染料Cal-520 AM (AAT Bioquest)溶于DMSO中，加入20%Pluronic F-127，最终浓度为567μM，用于标记Au1中的L2/3神经元。将注有Cal-520 AM染料的电极插入到皮层表面200μm深的皮层中， 250 mbar注射5 min。1小时后，染料已经被细胞充分吸收，使用基于12.0 kHz谐振扫描仪的定制双光子显微镜系统(苏州生物医学工程与技术研究所LotosScan 1.0型)进行双光子成像。双光子激发光由锁模Ti:Sa激光器(型号“Mai-Tai DeepSee”，光谱物理)在920 nm的近红外(NIR)波长下传输。成像使用40×/0.8 NA(尼康)水浸物镜，该物镜工作距离3.5 mm，可以从侧面进行电极操作。<br>　　研究结果：<br>　　1.中红外光照射可以诱发神经元c-Fos的表达。<br>　　我们首先移除视觉皮层上方的颅骨，然后使用上述中红外光照射大脑皮层20 s。经c-Fos 免疫组化后，发现刺激区域部分细胞被激活。激活区域类似子弹头形状，横向和轴向距离约为400μm，基本位于皮层的2/3层处。为了鉴定激活细胞的类型，我们使用神经元标记物NeuN进行共标记，结果显示约有89%的共标记细胞，说明被激活的细胞以神经元为主。为了检验照射时间的依赖性，我们分别对5 s、10 s、20 s和60 s的照射时间进行了测试，然后进行c-Fos免疫组化染色。我们发现，照射时间越长，被激活的神经元越多。以上这些实验中，照射区域小鼠的颅骨是完全揭开的，后面我们尝试将颅骨磨薄至50μm，中红外照射20 s后进行c-Fos免疫组化染色。结果发现，部分神经元仍被激活，但与直接照射大脑皮层20 s相比，激活效率有所降低。通过以上这些实验，我们发现中红外照射可以直接激活神经元，不需要额外的蛋白质介导，与光遗传学相比具有非侵入性的优点，操作更容易，具有应用于更高级动物甚至人类的潜力。<br>　　2.中红外光照射可以增加神经元的放电频率。<br>　　我们使用电生理细胞贴附式来记录中红外光照射下神经元的动作电位。结果发现，在中红外光的照射时间窗口内，神经元的放电频率增加，并且神经元的正常生理特性没有受到影响，如动作电位的半高宽。照射后神经元的放电频率恢复到照射前的水平，说明中红外照射的激活作用是可逆的。接下来，我们利用活体双光子成像技术研究中红外照射下皮层神经元效应的时空分布。首先，利用钙离子指示剂Cal-520 AM标记初级听觉皮层2/3层神经元，在双光子钙离子成像实验中观察中红外照射对神经元钙离子活动的变化。我们发现，在中红外照射的照射时间窗口内，部分神经元的钙活动明显增加。照射后神经元的钙活动恢复到照射前水平，也验证了之前的电生理结果，证实了中红外照射的可逆性。数据分析发现，中红外光激活的神经元比例约为10%，且这些神经元分散在大脑皮层中，没有明确的空间位置关系。<br>　　3.中红外激活神经元的机制。<br>　　中红外照射可引起皮层温度升高，但升高数值不高，平均只有 0.6℃，不足以引起神经元兴奋性的改变。因此，我们认为温度升高不能解释神经元的激活机制，具体的激活机制需要进一步的实验。<br>　　研究结论：<br>　　1. 中红外光可以激活大脑皮层神经元。<br>　　2. 中红外光激活神经元的比例约为10%。<br>　　3. 中红外光激活神经元的机制不能用温度升高来解释。<br>　　4. 中红外光可以提高小鼠联合型学习速度。