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摘要研究背景和目的<br>　　糖尿病溃疡是糖尿病的常见并发症之一，其局部微环境紊乱、破坏创面正常愈合过程，导致创面迁延不愈。传统治疗方法如清创、皮瓣移植等疗效不佳，需积极研究糖尿病溃疡的有效促愈治疗方法。<br>　　间充质干细胞具有多向分化、低免疫原性、控制炎症和分泌多种生物活性因子等优点，广泛应用于糖尿病溃疡愈合等再生修复领域的研究。基于间充质干细胞的治疗方式主要分为活细胞治疗和无细胞治疗，单纯间充质干细胞活细胞移植治疗糖尿病溃疡已在动物研究上取得较好的效果，然而移植细胞存活少且存活时间短使其在临床转化阶段未能达到预期疗效；同时活细胞移植的远期生物安全性缺乏有力证据支持。富含生物活性因子的无细胞治疗一定程度上减轻了活细胞移植带来的相关风险，其作为干细胞替代物逐渐受到关注。但两者同样存在植入后受创面环境破坏、效能发挥受限问题，因此需进一步优化基于间充质干细胞的细胞及无细胞治疗。血红素氧合酶-1（Hemeoxygenase-1,HO-1）具有调节炎症及氧化应激、减少凋亡等细胞保护效应，有研究报道诱导间充质干细胞过表达HO-1可以提高细胞存活、迁移、旁分泌等功能。此外，糖尿病溃疡常见辅助治疗手段包括高压氧、负压、光治疗等，其中远红外光（Farinfraredradiation,FIR）治疗风险小、成本低，可促进生物活性因子的吸收，尤其是石墨烯FIR，其与人体频谱接近、作用于人体更具安全性及有效性，据此我们有理由推测石墨烯FIR可能有助于促进创面局部对无细胞治疗中生物活性因子的吸收，但目前暂无关于石墨烯FIR联合无细胞治疗糖尿病溃疡的相关研究。<br>　　因此，为提高治疗有效性，本课题拟构建过表达HO-1的骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs），探讨过表达HO-1对BMSCs活性的影响及过表达HO-1的BMSCs对糖尿病溃疡愈合的影响；并进一步获取过表达HO-1的BMSCs的无细胞提取液，对比探讨其单独或联合FIR治疗糖尿病溃疡的疗效差异；为探寻基于间充质干细胞的优化有效的糖尿病溃疡促愈方案提供基础研究证据。<br>　　材料与方法<br>　　1.过表达HO-1的BMSCs的体外活性研究：全骨髓贴壁法培养获得小鼠BMSCs，通过形态及成脂诱导分化鉴定细胞；通过腺病毒（Adenovirus，Adv）转染构建过表达HO-1的BMSCs（BMSCs-HO-1），通过荧光显微镜、流式细胞术及Westernblot检测转染效果；分别采用MTT实验、细胞划痕实验、ELISA、RT-PCR、荧光探针法检测高糖培养条件（25mM）下过表达HO-1对BMSCs增殖、迁移、旁分泌、促炎因子TNF-α和IL-6水平、ROS水平的影响。<br>　　2.在体实验研究过表达HO-1的BMSCs对糖尿病溃疡愈合的影响及相关机制：采用链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导构建小鼠糖尿病模型，小鼠背部脱毛后对称制作两个直径为6mm的创面。将小鼠随机分为四组，制创后当天进行相应处理：对照组（正常小鼠创面不予以任何治疗）、糖尿病溃疡组（小鼠糖尿病溃疡予以创缘注射PBS）、BMSCs组（小鼠糖尿病溃疡予以创缘注射BMSCs细胞悬液）、BMSCs-HO-1组（小鼠糖尿病溃疡创面予以创缘注射BMSCs-HO-1细胞悬液）；分别在治疗后第0、3、7、11天观察创面愈合情况并进行图像采集，采用ImageJ进行创面愈合率计算；取第14天创面组织进行HE染色、Masson染色、VEGF免疫组化对比分析各组组织愈合情况；取第3、7天创面组织通过免疫荧光示踪对比分析移植细胞存活及迁移情况；取第7天创面组织通过Westernblot检测p-Akt及Caspase-3蛋白水平以初步探索参与调控细胞活性的PI3K/Akt、Caspase-3介导的相关信号通路；取1、3、7、11天创面组织通过RT-PCR检测TNF-α、IL-6水平以反应创面炎症情况；取第0、7、14天创面组织通过ELISA检测参与内源性干细胞招募的趋化因子SDF-1α蛋白水平。<br>　　3.研究过表达HO-1的BMSCs的无细胞提取液联合石墨烯远红外光治疗对糖尿病溃疡愈合的影响及相关机制：采用不含血清的DMEM/F-12培养基孵育细胞以获得无细胞提取液；将小鼠随机分为五组：对照组（正常小鼠创面不予以任何治疗）、糖尿病溃疡组（小鼠糖尿病溃疡予以创缘注射PBS）、FIR组（小鼠糖尿病溃疡创面予以石墨烯远红外光治疗）、BMSCs-HO-1-CE组（小鼠糖尿病溃疡予以BMSCs-HO-1的无细胞提取液治疗）、联合组（小鼠糖尿病溃疡予以石墨烯远红外照射及BMSCs-HO-1的无细胞提取液治疗）。分别于第0、5、11天观察创面愈合情况、采用ImageJ进行创面愈合率计算；采用HE染色、Masson染色、VEGF免疫组化观察各组组织愈合情况；于第3、7、11天采用荧光探针法检测创面总Ca2+浓度；于第3、5、11天采用RT-PCR及分光光度法检测创面TNF-α、IL-6及ROS水平。<br>　　结果<br>　　1.过表达HO-1的BMSCs的体外活性研究：所提细胞呈成纤维样、聚集形成漩涡样贴壁生长，成脂诱导21天后油红O染色可见红色脂滴；荧光显微镜下观察到Adv转染（MOI=200）的BMSCs具有较强的绿色荧光，流式细胞术分别检测未转染、转染Adv空载体、转染携带HO-1基因的Adv的BMSCs的绿色荧光占比分别约为0.7％、78.5％及62.6％，Westernblot结果显示转染携带HO-1基因的Adv的BMSCs中HO-1蛋白表达量明显升高（P＜0.05）；BMSCs-HO-1在高糖培养条件下（25mM）的细胞增殖、迁移及旁分泌EGF、TGF-β能力较BMSCs显著提高（P＜0.05），TNF-α和IL-6及ROS水平明显降低（P＜0.05）。<br>　　2.在体实验研究过表达HO-1的BMSCs对糖尿病溃疡愈合的影响及相关机制：STZ诱导后1周小鼠空腹血糖＞16.7mmol/L，制创后糖尿病小鼠平均愈合时间约19.8天，较正常小鼠（约11.7天）延长（P＜0.05）；创面治疗后第11天，BMSCs-HO-1组创面愈合率约为99.1％，较BMSCs组（约90.7%）高（P＜0.05）；第14天创面组织特殊染色结果显示BMSCs-HO-1组的上皮厚度、胶原纤维含量、VEGF蛋白阳性表达均显著高于BMSCs组（P＜0.05）；RT-PCR结果显示BMSCs-HO-1组的创面促炎因子TNF-α和IL-6水平明显低于BMSCs组（P＜0.05）；GFP原位荧光示踪显示BMSCs-HO-1组中GFP阳性细胞多于BMSCs组且细胞迁移分散在皮肤各层；Westernblot及ELISA结果显示BMSCs-HO-1组p-Akt及SDF-1α蛋白水平增加，Caspase-3蛋白水平降低，与BMSCs组相比差异存在统计学意义（P＜0.05）。<br>　　3.研究过表达HO-1的BMSCs的无细胞提取液联合石墨烯远红外光治疗对糖尿病溃疡愈合的影响及相关机制：创面治疗后第5、11天联合组的创面愈合率达57.9%、99.9%均显著高于BMSCs-HO-1-CE组（43.7%、83.7%）和FIR组（37.6%、80.3%）（p＜0.05）。组织特殊染色结果显示第14天联合组创缘组织的表皮厚度较厚、真皮Masson染色胶原纤维容积为50.2％，VEGF阳性信号OD值达0.7，均显著高于其他各组（p＜0.05）；Westernblot结果显示联合组Caspase-3蛋白水平低于其余各组（p＜0.05）；联合组创面组织中Ca2+浓度较高，ROS及TNF-α、IL-6水平降低，与其余各组差异存在统计学意义（p＜0.05）。<br>　　小结<br>　　1.过表达HO-1的BMSCs具有更强的存活、迁移及旁分泌能力，能更有效地加快糖尿病溃疡愈合；这可能是通过激活PI3K/Akt通路、抑制Caspase-3介导的细胞凋亡通路发挥细胞保护作用，同时可能通过增加趋化因子SDF-1α水平以招募内源性干细胞至创面发挥作用。<br>　　2.过表达HO-1的BMSCs的无细胞提取液联合石墨烯FIR治疗能明显减轻创面炎症及氧化应激、促进糖尿病溃疡愈合；这可能是通过调节Ca2+及Caspase-3介导的相关信号通路实现的。