检索历史 清除

摘要目的：肿瘤抑制性微环境是免疫治疗效果不佳的重要原因，目前尚未有调节肿瘤微环境的药物组合上市。Icaritin（ICT）是一种多羟基黄酮类化合物，提取自淫羊藿属植物，用于治疗晚期肝癌。CpG-ODN（CpGoligonucleotide）是一类TLR9激动剂，通过与抗原提呈细胞（Antigen-presentingcells,APCs）中TLR9结合，促进APCs的活化。本研究推测Icaritin联合CpG-ODN可能调节肿瘤微环境，有利于抗肿瘤免疫应答。通过B16F10细胞探究Icaritin对免疫原性的影响，与CpG-ODN联用分析CD8+T细胞能否受到活化；在黑色素瘤荷瘤小鼠中观察联合用药的抑瘤效果并分析肿瘤微环境的变化，最后使用免疫检查点抑制剂（Immunecheckpointinhibitor,ICI）验证肿瘤微环境的调节效果。<br>　　方法：本研究使用B16F10和B16-luc两种细胞系研究Icaritin联合CpG-ODN对黑色素瘤荷瘤小鼠的影响，按照以下步骤进行：1.免疫原性指标检测：用不同浓度Icaritin（10、20、40μM）处理B16F10肿瘤细胞，流式细胞术分析Icaritin对B16F10细胞的凋亡影响。分析B16F10细胞表面PD-L1，MHC-I，CD80，CD95分子表达情况。2.脾细胞活化检测：20μMIcaritin处理后的B16F10细胞碎片和CpG-ODN共同刺激脾细胞，培养48小时，用流式细胞术检测CD8+T细胞的活化情况。3.肿瘤治疗实验：建立B16F10小鼠黑色素瘤模型，从第三天开始每只小鼠给与35mg/kgIcaritin；第11天，单次瘤内注射1mg/kgCpG-ODN。绘制肿瘤生长曲线，计算肿瘤抑制率。在此期间，每隔1天测量一次肿瘤大小。体积=长×宽2×1/2，肿瘤抑瘤率：抑瘤率（%）=［1－（治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重）］×100%。对于荷瘤小鼠生存分析，观察50天以上，记录小鼠死亡情况。4.肿瘤活体成像：使用B16-luc细胞系小鼠荷瘤，并进行治疗，在第11、14、19、21天记录肿瘤的生长图像，用IVISSpectrum体内成像系统测量荧光素酶活性。5.肿瘤坏死情况分析：分离肿瘤组织制备Hamp;E切片，ImageJ分析肿瘤组织的坏死面积。6.肿瘤组织免疫原性分析：流式细胞术分析肿瘤细胞表面CD95、MHC-1、CD80、PD-L1表达情况。7.肿瘤浸润CD8+T分析：流式细胞术和免疫荧光染色分析肿瘤微环境中浸润的CD8+T细胞数量，流式细胞术分析CD8+T细胞功能。8.肿瘤微环境免疫亚群分析：流式细胞术分析肿瘤微环境中DCs细胞的活化情况，Th1和Treg细胞的比例，计算CD8/CD4、CTL/Treg的比例。9.肿瘤引流淋巴结中，通过流式细胞术检测中央记忆CD8+T细胞。10.检验肿瘤微环境的调节效果：在上述B16F10荷瘤小鼠使用Icaritin和CpG-ODN治疗基础上，第11、14、17天腹腔注射anti-PD-1（5mg/kg）和anti-CTLA-4（10mg/kg）抗体，收集肿瘤生长曲线和计算肿瘤抑制率来评价治疗效果。<br>　　结果：1.体外实验结果显示，20、40μMIcaritin可诱导B16F10细胞凋亡，差异有统计学意义（P＜0.0001），10μMIcaritin处理后的肿瘤细胞凋亡情况与对照组并没差异。10、20μMIcaritin处理后的肿瘤细胞表面PD-L1分子表达下降；MHC-I、CD80、CD95分子表达水平提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。2.Icaritin处理后的B16F10细胞碎片与0.1μMCpG-ODN增加CD44+CD69+CD8+T细胞比例，差异有统计学意义（P＜0.01）。3.Icaritin与CpG-ODN联合治疗显著抑制B16F10小鼠黑色素瘤生长，差异有统计学意义（P＜0.01）。Icaritin联合CpG-ODN与未治疗组相比，肿瘤生长抑制率为73.41%，显著高于单纯CpG-ODN治疗组（45.80%）和单纯35mg/kgIcaritin治疗组（29.22%）。4.Icaritin与CpG-ODN联合治疗显著延长B16F10黑色素瘤荷瘤小鼠的生存时间，90%的荷瘤小鼠生存时间超过50天以上，效果优于Icaritin（P＜0.0001）或CpG-ODN（P＜0.01）单个药物应用，差异有统计学意义。5.Hamp;E染色表明Icaritin与CpG-ODN联合治疗促进肿瘤组织坏死，差异有统计学意义（P＜0.05）。6.Icaritin与CpG-ODN联合治疗后的荷瘤小鼠肿瘤细胞免疫原性增加，流式结果表明肿瘤细胞表面PD-L1分子表达下降，MHC-I、CD80、CD95分子表达水平提高，与其他组相比均有差异（P＜0.05）。7.免疫荧光和流式结果表明，Icaritin与CpG-ODN联合治疗增加肿瘤浸润CD8+T细胞比例，与其他三组相比均有差异（P＜0.05）。8.Icaritin与CpG-ODN联合治疗后肿瘤浸润CD8+T细胞功能增强，Ki67阳性率更高，能够分泌更多IFN-γ和TNF-α，与另外三组相比均有差异（P＜0.05）。9.Icaritin与CpG-ODN联合治疗增加肿瘤浸润杀伤性T细胞和Th1细胞频率，CD8/CD4和CTL/Treg比例也增加，与单一药物治疗和未治疗组相比均有差异（P＜0.05）。10.Icaritin联合CpG-ODN治疗组肿瘤浸润的DCs频率是未治疗组的2.86倍，是Icaritin单药治疗组的1.68倍。但CpG-ODN单药治疗组与Icaritin联合CpG-ODN治疗组间肿瘤浸润DCs的频率差异无统计学意义（P=0.37）。11.Icaritin联合CpG-ODN治疗组肿瘤浸润的DCs表达CD40和MHC-I增加，与单一药物治疗和未治疗组相比均有差异（P＜0.05）。12.Icaritin联合CpG-ODN治疗增加引流淋巴结中CD8+记忆T细胞比例，与未治疗组（P＜0.0001）和Icaritin组（P＜0.05）均有差异，但与CpG-ODN组比较无明显差异（P=0.118）。13.Icaritin联合CpG-ODN治疗后改善黑色素瘤的肿瘤微环境，提高免疫检查点抑制剂治疗的反应性，肿瘤抑制率高达90%以上。<br>　　结论：1、Icaritin能促进B16F10肿瘤细胞死亡，促进CD95，CD80，MHC-I分子表达，抑制PD-L1表达，增加肿瘤细胞免疫原性，有利于肿瘤抗原的释放过程。2、Icaritin联合CpG-ODN治疗能够抑制黑色素瘤荷瘤小鼠的肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存时间。3、Icaritin联合CpG-ODN治疗黑色素瘤荷瘤小鼠主要作用于肿瘤局部，通过促进T细胞活化，增加肿瘤浸润CD8+T细胞，并强化CD8+T细胞功能，改变肿瘤浸润T细胞亚群的比例，发挥调节肿瘤微环境的作用，同时也影响了肿瘤微环境中DCs的活化。4、Icaritin联合CpG-ODN治疗改善肿瘤微环境，提高B16F10黑色素瘤对免疫检查点抑制剂PD-1和CTLA-4阻断抗体的反应性。作为不依赖肿瘤特异性标志物的治疗方案，给其他小分子药物的研究提供了一种思路，并且丰富了CpG-ODN免疫佐剂的应用，为临床黑色素瘤的治疗提供了一定的参考方案。