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摘要目的：<br>　　近年来，传统手术联合放化疗和辅助免疫治疗在肺腺癌（Lungadenocarcinoma，LUAD）和胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）的治疗和预后取得了重大进展，然而免疫治疗策略仍面临诸多挑战，亟需应对解决。本研究基于肿瘤异质性，利用单细胞测序数据库对肿瘤免疫微环境进行生物信息学分析，并通过流式细胞术验证；基于生物信息学分析结果，利用高表达趋化因子受体2（Chemokinereceptor2，CCR2）的慢病毒载体转染CD8+肿瘤浸润T淋巴细胞（Tumor-infiltratingTlymphocytes，TILs），通过体内外实验，研究CCR2高表达的CD8+TILs以及联合抗PD1在小鼠LUAD和GBM的抗肿瘤作用。该研究结果将为肿瘤免疫治疗提供新的靶点和一定的理论支持。<br>　　方法：<br>　　1.利用TCGA数据库中的LUAD数据进行生物信息学分析。（1）将数据库中13670个免疫微环境中的CD8+T细胞降维分成4个细胞亚群。（2）筛选细胞亚群的免疫检查点分子并利用流式细胞术验证。（3）伪时间轨迹分析细胞亚群的耗竭趋势。（4）利用数据库中的临床数据分析细胞亚群与总体生存率的相关性并通过临床标本验证。<br>　　2.通过体内外实验，研究高表达CCR2的CD8+TILs以及联合抗PD1在LUAD和GBM的抗肿瘤作用。<br>　　2.1.高表达CCR2的CD8+TILs以及联合抗PD1在LUAD的抗肿瘤作用。（1）构建小鼠Lewis肺癌（Lewislungcarcinoma，LLC）模型，利用磁珠分选肿瘤组织的CD8+TILs。（2）慢病毒转染CD8+TILs。（3）CD8+TILs和LLC细胞共培养，分为四组：空载体转染CD8+TILs组（CD8+T）、高表达CCR2慢病毒转染CD8+TILs组（CD8+TCCR2+）、抗PD1组（CD8+Tanti-PD1）、高表达CCR2慢病毒转染CD8+TILs和抗PD1联合处理组（CD8+Tanti-PD1/CCR2+）；流式细胞术检测CD8+TILs的CD69、CD107A、IFN-γ、GranzymeB表达。（4）流式细胞术检测LLC细胞凋亡，CCK8检测LLC细胞增殖。（5）瘤旁注射不同分组的CD8+TILs，测量小鼠肿瘤体积；制作小鼠肿瘤冰冻切片，共聚焦显微镜检测迁移至肿瘤组织中的回输CD8+TILs的趋化作用。<br>　　2.2.高表达CCR2的CD8+TILs以及联合抗PD1在GBM的抗肿瘤作用。（1）免疫组织化学检测人GBM临床标本和小鼠胶质瘤的CCR2表达。（2）构建小鼠GL261（Mouseglioma261，GL261）胶质瘤模型，利用磁珠分选肿瘤组织、脾脏、外周血CD8+T细胞，流式细胞术检测CD69、CD107A、CCR2表达。（3）转染CCR2高表达慢病毒，CD8+TILs分别与GL261细胞共培养24h、48h、72h后（分组同2.1（3）），流式细胞术检测CD69、CD107A、IFN-γ、GranzymeB表达。（4）流式细胞术检测GL261细胞凋亡，CCK8检测GL261细胞增殖。（5）瘤旁注射不同分组的CD8+TILs，通过测量小鼠肿瘤体积评估治疗效果。<br>　　结果：<br>　　1.数据库生物信息学分析结果显示，CD8+T细胞降维分成C1、C2、C3和C4细胞亚群。与其他亚群比较，具有杀伤活性的C1亚群CD8+T细胞显示更好的预后相关性；高度富集在肿瘤微环境的C2亚群显示为耗竭性CD8+T细胞，并提示阻断PD1可能逆转耗竭。<br>　　2.高表达CCR2的CD8+TILs以及联合抗PD1在LUAD和GBM的抗肿瘤作用。<br>　　2.1.高表达CCR2的CD8+TILs以及联合抗PD1在LUAD的抗肿瘤作用。<br>　　（1）成功构建小鼠LLC模型，提取纯化肿瘤组织中CD8+TILs。（2）成功转染CCR2高表达慢病毒。（3）构建不同处理组，共培养结果显示，比较CD8+T组和CD8+Tanti-PD1组，CD8+TCCR2+组的CD69表达更高（P＜0.0001）；比较CD8+TCCR2+组，CD8+Tanti-PD1/CCR2+组的CD69表达无差异（P＞0.05）。比较CD8+T组和CD8+Tanti-PD1组，CD8+TCCR2+组的IFN-γ和GranzymeB表达更高（P＜0.05）；比较CD8+TCCR2+组，CD8+Tanti-PD1/CCR2+组的IFN-γ和GranzymeB表达更高（P＜0.05）。（4）比较其他各组，CD8+Tanti-PD1/CCR2+组的LLC细胞的凋亡率最高（P＜0.05），细胞增殖最低（P＜0.05）。（5）小鼠体内实验结果显示，比较其他组，CD8+Tanti-PD1/CCR2+组的肿瘤体积最小；肿瘤组织冰冻切片结果显示，比较CD8+T组，CD8+TCCR2+组的肿瘤组织有更多的慢病毒转染CD8+TILs浸润。<br>　　2.2.高表达CCR2的CD8+TILs以及联合抗PD1在GBM的抗肿瘤作用。<br>　　（1）免疫组织化学结果显示，人GBM临床标本和小鼠GL261胶质瘤组织的结果一致。CCR2在胶质瘤组织和癌旁组织的表达存在差异（P＜0.0001）。（2）成功构建小鼠GL261模型，提取纯化肿瘤组织、外周血和脾脏中CD8+T细胞，比较外周血和脾脏，CD69、CD107A、CCR2的表达量在肿瘤部位的CD8+TILs中最多。（3）成功转染CCR2高表达慢病毒，构建不同处理组，共培养结果显示，比较CD8+T组和CD8+Tanti-PD1组，CD8+TCCR2+组的CD69和CD107A表达更高（P＜0.0001）；比较CD8+TCCR2+组，CD8+Tanti-PD1/CCR2+组的CD69和CD107A表达无差异（P＞0.05）。比较CD8+T组和CD8+Tanti-PD1组，CD8+TCCR2+组的IFN-γ和GranzymeB表达更高（P＜0.05）；比较CD8+TCCR2+组，CD8+Tanti-PD1/CCR2+组的IFN-γ表达更高（P＜0.01）。（4）比较其他各组，CD8+Tanti-PD1/CCR2+组的GBM细胞的凋亡率最高（P＜0.05），细胞增殖最低（P＜0.05）。（5）小鼠体内实验结果显示，比较其他各组，CD8+Tanti-PD1/CCR2+治疗组的肿瘤体积最小。<br>　　结论：<br>　　1.耗竭性CD8+TILs是潜在的免疫治疗细胞亚群，阻断PD1可能逆转CD8+TILs的耗竭。<br>　　2.高表达CCR2通过促进LUAD的CD8+TILs早期活化、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和促进CD8+TILs向肿瘤组织迁移，发挥抗肿瘤作。<br>　　3.高表达CCR2通过促进GBM的CD8+TILs活化和杀伤、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的增殖，发挥抗肿瘤作用。<br>　　4.联合使用高表达CCR2的CD8+TILs和抗PD1在LUAD和GBM均具有高效抗肿瘤作用。