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摘要第一部分AHCY基因调控肝母细胞瘤增殖凋亡的机制研究<br>　　研究目的<br>　　在儿童肝脏恶性肿瘤中肝母细胞瘤(hepatoblastoma，HB)最为常见，其通常在3岁以内发病。肝母细胞瘤目前的治疗以手术和化疗为主，虽然总体治愈率较高，但对于复发或伴有转移的患儿，其总体生存率尚不理想，且化疗药物的副作用亦影响患儿的预后和长期结局。靶向药物治疗和免疫疗法在临床的应用有望进一步提高肝母细胞瘤的治疗水平并降低当前治疗的毒性。本文旨在探讨肝母细胞瘤发生发展的潜在机制。<br>　　研究方法<br>　　团队前期对来自同一患者的一块正常肝组织及三块肿瘤组织进行了单细胞测序，我们对测序的结果进行了系统全面地分析，随后再结合国内外研究文献筛选出一个候选基因—AHCY基因。为探索AHCY基因在肝母细胞瘤的发生发展中所起的作用，对包含HB肿瘤组织及癌旁组织的蜡块进行免疫组织化学染色检测AHCY蛋白的在肿瘤与癌旁的表达差异。之后进一步探讨AHCY基因在体内外对HB增殖及凋亡的影响。首先瞬时转染质粒干扰AHCY基因的表达，筛选出最佳干扰片段。为了稳定的敲低AHCY基因在人肝母细胞瘤细胞系HUH6、HepG2中的表达量，使用最佳干扰片段构建由慢病毒介导的shRNA（短发夹RNA）并转入细胞系中。随后通过CCK-8实验、克隆形成实验探究AHCY对人肝母细胞瘤细胞系增殖能力的影响；通过Tunel荧光染色实验、流式细胞仪检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法探究AHCY对人肝母细胞瘤细胞系凋亡的影响。通过裸鼠体内成瘤实验探究AHCY在体内对肝母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响，通过肿瘤增长曲线及裸鼠肿瘤组织免疫组织化学染色法检测ki-67蛋白表达量验证AHCY在体内对肝母细胞瘤增殖能力的影响；通过裸鼠肿瘤组织Tunel荧光染色及Westernblot（WB）实验检测caspase-3蛋白表达量验证AHCY在体内对肝母细胞瘤凋亡能力的影响。最后为了更进一步探究AHCY基因通过何种机制调控人肝母细胞瘤的增殖及凋亡，通过转录组测序技术对人肝母细胞瘤细胞系HUH6的shRNA-NC组及shRNA-AHCY组细胞进行了检测，之后通过生物信息学分析了两组细胞组间差异表达基因，最后对差异表达基因进行了GO、KEGG富集分析，结合以上分析结果可以预测AHCY基因参与到哪些生物学过程和通路，然后通过Westernblot（WB）实验检测通路明星分子的表达是否与测序结果一致。<br>　　研究结果<br>　　1.本课题对45例肝母细胞瘤肿瘤及瘤旁组织蜡块进行了免疫组化染色检测AHCY蛋白的表达，染色结果显示肿瘤组织中的AHCY蛋白表达量高于瘤旁组织。<br>　　2.体外实验，在人肝母细胞瘤细胞系HUH6和HepG2中瞬时转染质粒或慢病毒介导的shRNA（短发夹RNA）稳定敲低AHCY基因的表达量，实验结果显示人肝母细胞瘤细胞的shRNA-AHCY组较shRNA-NC组增殖能力减弱，凋亡细胞增多。<br>　　3.体内实验，把慢病毒载体介导的shRNA转入人肝母细胞瘤细胞系HUH6及HepG2中稳定敲低AHCY基因后注入裸鼠皮下，注入AHCY基因表达下调组shRNA-AHCY组细胞的裸鼠肝母细胞瘤组织增长速度较注入对照组细胞减慢且凋亡细胞增多。<br>　　4.通过转录组测序技术对人肝母细胞瘤细胞系HUH6的shRNA-AHCY组及shRNA-NC组细胞进行检测，检测结果为AHCY基因调控细胞增殖及凋亡主要是通过PI3K/AKT通路。<br>　　5.最后验证测序结果，通过Westernblot（WB）实验检测PI3K/AKT通路明星分子的表达，结果证实AHCY基因调控细胞增殖及凋亡主要是通过PI3K/AKT通路。<br>　　结论<br>　　AHCY有望成为肝母细胞瘤早期诊断的潜在生物学标志物，为肝母细胞瘤分子靶向治疗提供新的靶点。<br>　　第二部分计算机辅助手术系统在小儿外科中的应用及价值<br>　　研究目的<br>　　HisenseCAS计算机辅助手术系统能弥补传统CT、MRI二维影像的不足，清晰立体显示病灶大小、位置及周围血管的空间毗邻关系，了解血管走行及解剖变异。本研究旨在探讨HisenseCAS计算机辅助手术系统三维重建技术在小儿外科疾病中的应用及意义。<br>　　研究方法<br>　　回顾性分析2016年3月至2022年10月本院323例行术前三维重建患儿的临床病理资料。其中男童146例，女童177例，年龄1个月-12岁，平均年龄3.6岁，所收集的病例中患儿术前均采用HisenseCAS计算机辅助手术系统对病灶及周围组织进行三维重建，精准了解血管与病灶关系，模拟切除，计算剩余脏器体积，规划手术方案，观察患儿血管走行及变异。每个病例由至少两位主治及以上级别医生依据三维图像评估患儿能否Ⅰ期手术，可行Ⅰ期手术患儿进一步规划手术方案并进行模拟切除；不能Ⅰ期手术的患儿则行化疗后再次评估。结合患儿治疗方案及计算机辅助手术系统行模拟切除肿瘤的体积探讨计算机辅助手术系统在小儿外科中的应用及价值。<br>　　研究结果<br>　　1.2016年3月至2022年10月于我院小儿外科行术前三维重建并进行手术治疗的病例323例，重建例次达372例。323例患儿均按术前设计方案顺利进行了手术。其中先天性胆总管扩张87例，肝母细胞瘤62例，神经母细胞瘤46例，畸胎瘤33例，腹膜后肿物20例，肾母细胞瘤16例，其他肿瘤14例，间叶肿瘤11例，肾上腺肿物10例，肾积水9例，纵隔肿瘤9例，胰腺肿物6例。<br>　　2.收集的323例病例中病灶位于胸部的有28例，占总病例数的8.67%。28个病例中男童14例，女童14例；纵隔肿瘤9例，神经母细胞瘤8例，畸胎瘤7例，间叶肿瘤4例，；11例行开腹手术，17例行胸腔镜手术。依据三维图像25例可行Ⅰ期切除，3例神经母细胞瘤需先行化疗后再次评估手术可行性。<br>　　3.323个病例中病灶位于腹部的有282例，其中男童125例，女童157例；先天性胆总管扩张87例，肝母细胞瘤62例，神经母细胞瘤36例，畸胎瘤23例，腹膜后肿物20例，肾母细胞瘤16例，肾上腺肿物10例，肾积水9例，胰腺肿物6例，肾脏肿物5例，间叶肿瘤4例，肝脏良性肿瘤4例。见表3。132例行开放手术，139例行腹腔镜手术，8例腹腔镜中转为开放手术，3例行达芬奇机器人手术。据三维图像结果评估，248例可行Ⅰ期切除，34例需化疗后再次评估手术可行性。<br>　　4.323例病例中病灶位于盆腔的有13例，其中男童7例，女童6例；卵巢肿瘤5例，间叶肿瘤3例，神经母细胞瘤2例，畸胎瘤3例；行开放手术切除病灶的有5例，行腔镜手术有8例。依据三维重建结果，8例肿瘤均可行Ⅰ期切除，按术前规划手术方式进行治疗。<br>　　结论<br>　　HisenseCAS计算机辅助手术系统三维重建技术的应用可在术前为医生提供包括病灶与周围组织的毗邻关系、重要血管的变异等有效信息，使得手术可在相对精准的条件下施行。HisenseCAS计算机辅助手术系统是术前规划、术中操作和术后恢复上的重要辅助工具，具有一定临床应用价值。