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环状RNA hsa_circ_0079929通过激活PDE4D促进主动脉夹层中的内皮炎症

摘要目的<br>  主动脉夹层是非常常见的心血管疾病,普遍认为其以大血管中平滑肌细胞大量丢失导致血管结构异常为特点,当血流压力超过结构异常的大血管承受力时,往往会导致灾难性的后果。但目前主动脉夹层缺乏有效的非手术治疗手段。即使进行了手术治疗总体来说也难以保证良好的预后效果。而内皮功能障碍在学术界普遍被认为是主动脉夹层发生的早期血管变化。如果能够在主动脉夹层发生发展的内皮功能障碍期施加干预和治疗,那么就可能以较小的代价治愈主动脉夹层。同时,已有研究指出,通过关联潜在的生物学靶点制成疫苗可以明显降低动物实验中动脉粥样硬化的发生率。如果能够找到稳定可靠的与主动脉夹层相关的潜在生物学靶点,可能在不久的将来通过疫苗预防主动脉夹层的发生就可以实现。因此尽可能寻找主动脉夹层相关的潜在生物学靶点来早期预测和治疗主动脉夹层就显得意义巨大。非编码RNA在人类转录组中占据相当大的比例,而环状RNA以其可以成环的独特构造具有优秀的稳定性。因此我们在已有研究的基础上,筛选出在主动脉夹层临床样本中表达量异常的环状RNA:hsa_circ_0079929为研究目标。并通过对其在人脐静脉内皮细胞中与内皮功能障碍相关的机制的探索,试图确定一个潜在的生物学靶点。<br>  方法<br>  首先基于已有的测序研究,结合收集的临床样本中目的分子的实时荧光定量QRT-PCR(QuantitativeReal-timeQRT-PCR,qRT-PCR)检测,确定目的非编码RNA;而后,构建hsa_circ_0079929的荧光探针,进行细胞荧光染色。为了进一步探索hsa_circ_0079929的功能,我们设计并合成hsa_circ_0079929的小干扰RNA转染进人脐静脉内皮细胞,通过qRT-PCR实验检测其沉默效率;通过划痕实验、Transwell实验和cck-8实验检测细胞增值迁移功能;通过qRT-PCR检测刺激炎症情况;使用时间梯度对的LPS处理人主动脉平滑肌细胞寻找最佳体外病理条件;构建hsa_circ_0079929的模拟物转染进人脐静脉内皮细胞,通过qRT-PCR实验检测了其转染效率;随后,我们通过生物信息学预测和RNA-pulldown实验来预测确定了其下游靶标;接下来设计合成了下游靶标的干扰剂和模拟物,分别转染人脐静脉内皮细胞检测炎症因子的表达水平;通过将hsa_circ_0079929和下游分子共转染人脐静脉内皮细胞,验证两个分子间的互作关系;通过细胞qRT-PCR实验和western实验检测分别经过hsa_circ_0079929小干扰RNA以及下游靶标抑制剂处理后的人脐静脉内皮细胞中NF-κB的激活情况。<br>  结果<br>  通过qRT-PCR实验我们发现了hsa_circ_0079929相比于血管平滑肌细胞在人脐静脉内皮细胞中表达量更高;FISH实验结果表明,hsa_circ_0079929主要存在于细胞质中;细胞功能实验表明,人脐静脉内皮细胞在敲低hsa_circ_0079929后,表现出增殖能力和侵袭能力下降的趋势;同时其炎症情况也有所缓解;通过时间梯度LPS实验发现,使用1μg/mL的LPS在连续处理人脐静脉内皮细胞24小时后,能达到最佳的刺激炎症的效果。转染hsa_circ_0079929的模拟物处理人脐静脉内皮细胞后,炎症因子的表达有所上升;通过生物信息学预测和RNA-pulldown实验来预测确定了其下游靶标为hsa_mir_944。我们又分别构建了hsa_mir_944的干扰剂和模拟物,转染人脐静脉内皮细胞,并检测炎症因子的表达水平,发现前者刺激了炎症因子的表达而后者抑制了炎症因子的表达。并且我们通过共转染实验证实,hsa_circ_0079929与hsa_mir_944在LPS的作用下互为上下游关系;最终我们根据生物信息学分析与RNA-pulldown筛选出hsa_mir_944的下游即PDE4D。我们再一次检测了分别经过hsa_circ_0079929小干扰RNA以及hsa_mir_944抑制剂处理后的人脐静脉内皮细胞样本中NF-κB的激活情况,发现后者NF-κB通路明显被激活,而前者则被抑制。这一结果与炎症因子的检测结果相符合。<br>  结论<br>  我们的研究首次揭露了hsa_circ_0079929/hsa_mir_944/PDE4D这一通路的存在,并且提出了PDE4D激活NF-κB通路参与主动脉夹层中早期内皮损伤的这一可能。我们的研究提供了可能与主动脉夹层相关的潜在生物学靶点。

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