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摘要据我国卫生健康委员会发布的《中国出生缺陷防治报告》统计，我国每年新生儿出生缺陷发生率约为5.6%。导致出生缺陷的原因很复杂，主要受遗传因素、环境因素以及由它们共同作用，而妊娠期微生物感染是一类常见的环境因素。金黄色葡萄球菌（金葡菌，S.aureus）可定植于健康个体的皮肤、黏膜、生殖道等部位，是引起临床细菌感染性疾病最常见的病原菌之一，可导致化脓性炎症、败血症、食物中毒等疾病，当机体微生态失调后可引起内源性感染。目前研究发现，金葡菌感染也是导致孕妇不良妊娠结局及胎儿发育异常的重要因素。葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）是金葡菌产生的一种重要致病物质，也是一种重要的超抗原。与传统抗原相比，SEB可非特异性激活大量的T细胞，无需抗原提呈细胞的处理和提呈，在一定条件下受SEB刺激的T细胞被大量清除，致使T细胞数量和功能失调，造成微生物感染后产生的免疫抑制现象。<br>　　Hedgehog（Hh）信号通路在胚胎至成体的发育过程中扮演着重要角色，与胚胎发育、细胞增殖分化、组织形成修复以及免疫调节等密切相关。其中，Hedgehog不仅参与机体内T细胞形成和不同发育阶段的调节，还对外周T细胞的增殖活化以及功能进行调控，揭示Hedgehog信号通路在T细胞应答过程中扮演着更为重要的角色。导师课题组前期研究发现妊娠期孕鼠接触SEB对其子代鼠胸腺和脾脏T细胞数量和功能等细胞免疫产生明显影响，但妊娠期孕鼠接触SEB影响子代细胞免疫是否由SEB改变Hedgehog信号通路所致，目前国内外未见报道。因此，我们提出“妊娠期孕鼠接触SEB对子代鼠胸腺和脾脏中T细胞Hedgehog信号途径影响及与脾脏T细胞关系”假设，本论文主要通过western blot、real-time PCR、免疫磁珠分选、免疫荧光染色及细胞培养等方法研究SEB对子代鼠胸腺和脾脏T细胞Hedgehog信号通路分子在mRNA和蛋白水平的影响，并通过干预该通路探讨其与T细胞分化发育的关系，期望其研究结果为优生优育及胎源性疾病提供实验基础和理论依据。<br>　　研究目的：研究妊娠期孕鼠接触SEB对子代鼠胸腺和脾脏T细胞Hedgehog信号通路影响及与脾脏T细胞关系。<br>　　研究方法：<br>　　（1）SEB处理及实验分组：GD16给予孕鼠尾静脉注射0.3ml50μg/ml SEB，记为SEB组，同时设立PBS对照组。然后让孕鼠继续妊娠至孕期满，待自然分娩后，取一部分新生子代鼠在出生后14天进行研究，另一部分让其继续生长至成年期（出生后的第10周），分别无菌获取新生子代鼠、成年子代鼠的胸腺和脾脏进行后续研究。<br>　　（2）提取PBS组和SEB组新生子代鼠、成年子代鼠胸腺或脾脏组织的总RNA和总蛋白，通过real-time PCR和western blot检测其Hedgehog信号通路配体的表达水平。<br>　　（3）采用网搓法制备PBS组和SEB组新生子代鼠、成年子代鼠胸腺的单细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，提取其总RNA和总蛋白，通过real-time PCR和western blot检测胸腺淋巴细胞Hedgehog信号通路受体、转录因子及靶基因的表达水平。<br>　　（4）采用网搓法制备PBS组和SEB组新生子代鼠、成年子代鼠脾脏的单细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，通过MACS磁珠分选仪分选出CD4+T和CD8+T细胞，并提取其总RNA和总蛋白，通过real-time PCR和western blot检测脾脏CD4+T和CD8+T细胞Hedgehog信号通路受体、转录因子及靶基因的表达水平。<br>　　（5）采用免疫荧光染色法检测上述胸腺淋巴细胞、脾脏CD4+T和CD8+T细胞Gli1的表达及定位。<br>　　（6）成年子代鼠脾脏CD4+T细胞体外与抑制剂Gant61共培养24h后，通过western blot检测各组（PBS组、SEB组、抑制剂+PBS组、抑制剂+SEB组）Hedgehog信号通路和Wnt/β-catenin信号通路效应蛋白及靶蛋白表达水平。<br>　　（7）分离PBS组和SEB组成年子代鼠脾脏单个核细胞，分别加入抑制剂Gant61共培养24h后，收集细胞并进行荧光抗体染色，通过流式细胞术检测CD4+T细胞及CD8+T细胞亚群的百分率。<br>　　研究结果：<br>　　（1）与PBS组相比，SEB组新生子代鼠胸腺组织Hedgehog信号通路配体Shh、Dhh的表达水平明显增加。<br>　　（2）妊娠期孕鼠接触SEB明显减少新生子代鼠胸腺T淋巴细胞Hedgehog信号通路膜受体Ptch1、Smo及转录因子Gli1和靶基因CyclinD1、C-myc、N-myc的表达水平。<br>　　（3）妊娠期孕鼠接触SEB明显增加成年子代鼠胸腺组织Hedgehog信号通路配体Shh、Dhh的表达水平。<br>　　（4）SEB组成年子代鼠胸腺T淋巴细胞中Hedgehog信号通路膜受体Ptch1、Smo及转录因子Gli1和靶基因Bcl2、CyclinD1、C-myc、N-myc的表达水平较PBS组明显降低。<br>　　（5）妊娠期孕鼠接触SEB明显增加新生子代鼠脾脏组织中配体Shh、Dhh的表达水平。<br>　　（6）与PBS组相比，SEB组新生子代鼠脾脏CD4+T淋巴细胞Hedgehog信号通路受体Ptch1、Smo、Boc及转录因子Gli1和靶基因Bcl2、CyclinD1、N-myc的表达水平明显升高。<br>　　（7）妊娠期孕鼠接触SEB明显增加成年子代鼠脾脏组织中配体Shh、Dhh的表达水平。<br>　　（8）SEB组成年子代鼠脾脏CD4+T淋巴细胞中Hedgehog信号通路下游受体Ptch1、Smo及转录因子Gli1和靶基因CyclinD1、C-myc、N-myc表达水平较PBS组明显增加。<br>　　（9）妊娠期孕鼠接触SEB不引起成年子代鼠脾脏CD8+T淋巴细胞Hedgehog信号通路下游受体Ptch1、Smo、Boc、Cdon，转录因子Gli1、Gli2、Gli3及靶基因Bcl2、N-myc、CyclinD1、Vegfa表达水平的变化。<br>　　（10）成年子代鼠脾脏CD4+T细胞体外与Hedgehog信号通路抑制剂Gant61共培养后，PBS组和SEB组Hedgehog信号通路的Gli1蛋白表达明显降低，Hedgehog信号通路靶基因Bcl2、N-myc蛋白表达明显升高，Wnt信号通路下游靶蛋白CyclinD1、C-myc表达水平明显降低，同时抑制剂Gant61对SEB组Gli1、CyclinD1和C-myc蛋白表达的抑制率明显高于PBS组。<br>　　（11）成年子代鼠脾脏T细胞与Hedgehog信号通路抑制剂Gant61体外共培养后，抑制剂显著降低PBS组和SEB组成年子代鼠脾脏CD4+T细胞和CD8+T细胞百分率，增加CD4-CD8-T细胞亚群百分率，但抑制剂不改变PBS组和SEB组间CD4+T细胞或CD8+T细胞的抑制减少率。<br>　　研究结论：<br>　　1.妊娠期孕鼠接触SEB可以抑制新生子代鼠胸腺T淋巴细胞的Hedgehog信号通路，并将这种影响保留至成年子代鼠，即形成程序效应。<br>　　2.妊娠期孕鼠接触SEB可激活新生子代鼠脾脏CD4+T细胞的Hedgehog信号通路，并形成印迹效应保留至成年子代鼠；但妊娠期孕鼠接触SEB并不影响CD8+T细胞Hedgehog信号通路，即妊娠期孕鼠接触SEB对子代鼠脾脏T细胞Hedgehog信号通路的影响具有细胞选择性。<br>　　3.妊娠期孕鼠接触SEB对子代鼠中枢免疫器官胸腺和外周免疫器官脾脏中Hedgehog信号通路的影响存在器官差异性。<br>　　4.妊娠期孕鼠接触SEB增强子代鼠脾脏CD4+T细胞Hedgehog信号通路对抑制剂的反应性，但不改变Hedgehog信号通路抑制对成年子代鼠脾脏CD4+T、CD8+T亚群的影响，即妊娠期孕鼠接触SEB对脾脏T细胞的影响可能与其所致Hedgehog通路活化无关。