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摘要背景：结肠癌是当前严重威胁人类生命的恶性肿瘤之一，且发病率逐步提高。多数患者仍以传统的化疗、放疗或手术为主要治疗方式，但未取得满意的治疗效果。近年来，嵌合抗原受体T细胞（chimericantigenreceptorTcell，CAR-T）疗法在治疗B细胞等血液系统恶性肿瘤方面取得了巨大突破，但在实体瘤的治疗没有明显的进展。细胞间质上皮转换因子（cellular-mesenchymalepithelialtransitionfactor，c-Met）在胃癌、肝癌、结肠癌等多种实体肿瘤表面高表达，而在正常组织细胞表面低水平表达或不表达。靶向c-Met的CAR-T细胞在治疗实体肿瘤上具有较大的潜力。<br>　　目的：基于生物信息学和临床病理标本免疫组织化学，分析MET在结肠腺癌中的表达及对结肠腺癌的进展、预后的影响。制备靶向c-Met的CAR-T细胞，并观察其对结肠癌细胞HCT116的体外杀伤作用。<br>　　方法：1、通过GEPIA和HPA数据库初步探讨MET基因在结肠腺癌中的表达情况。同时GEPIA分析MET在结肠腺癌病理分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的表达差异和对患者生存预后的影响。UALCAN数据库分析MET基因表达与结肠腺癌的组织学亚型，及与患者种族、性别、体重、年龄、淋巴结转移状态之间的关系。TIMER数据库分析MET基因与免疫细胞浸润丰度的关系。CancerSEA数据库分析MET基因表达与血管生成、细胞周期、扩散、干细胞特性、炎症、转移和上皮间质转化之间的关系。cBioPortal数据库分析MET基因在结肠腺癌中的突变情况。STRING数据库制作蛋白互作网络图，分析MET与交互蛋白的作用。通过选取蚌埠医学院第一附属医院病理科的40例结肠癌肿瘤组织和20例癌旁组织进行免疫组化染色，以验证c-Met在结肠癌中的表达情况。<br>　　2、通过慢病毒感染的方式制备二代c-MetCAR-T细胞、CD19CAR-T细胞，Westernblot验证CAR序列的表达。流式细胞术检测c-MetCAR-T、CD19CAR-T细胞的阳性率，流式细胞术检测T、c-MetCAR-T和CD19CAR-T细胞的亚群比例。将体外实验进行分组。实验组：c-MetCAR-T细胞+HCT116细胞。对照组：CD19CAR-T细胞+HCT116细胞、T细胞+HCT116细胞。Nontarget组：c-MetCAR-T细胞+A2780细胞、CD19CAR-T细胞+A2780细胞、T细胞+A2780细胞。流式细胞术验证结肠癌细胞HCT116和卵巢癌细胞A2780表面c-Met蛋白的表达。CCK-8检测c-MetCAR-T细胞在24h、48h的增殖情况。LDH检测c-MetCAR-T细胞在效靶比为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时对HCT116细胞的杀伤率。ELISA检测c-MetCAR-T在靶抗原刺激下，细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌情况。<br>　　结果：1、GEPIA和HPA数据库显示MET基因在结肠腺癌中显著高表达（P＜0.01），GEPIA还发现MET基因表达与结肠腺癌病理分期、生存指标总生存期和无病生存期无关。免疫组化进一步证实了c-Met在结肠癌组织中高表达，其强阳性表达率为77.5%。UALCAN数据库显示，MET基因表达与结肠腺癌组织学亚型有关（P＜0.001），与患者的种族、性别、体重、年龄和淋巴结转移无关。TIMER数据库显示，MET基因表达与免疫细胞对结肠腺癌的浸润水平有关（P＜0.01）。cBioPortal数据库显示MET基因在结肠腺癌中的突变率为3.30%。CancerSEA数据库显示，MET基因表达与结肠腺癌血管生成、细胞周期、扩散、干细胞特性、炎症、转移和上皮间质转化成正相关（P＜0.05）。在STRING数据库中，发现与MET相互作用的蛋白评分较高且位于首位的是HGF。<br>　　2、Westernblot结果显示，在慢病毒感染后，CAR分子存在于CAR-T细胞中，表明成功构建二代c-MetCAR-T细胞。流式细胞术测得c-MetCAR-T、CD19CAR-T细胞的阳性率分别可达42.9%、91.9%。对于c-MetCAR-T细胞，在慢病毒感染后CD8+T细胞比例有所上调。流式细胞术结果显示，HCT116表面c-Met蛋白高表达，A2780表面c-Met蛋白阴性表达。CCK-8结果表明，在靶抗原存在时，c-MetCAR-T细胞的增殖潜力显著增强。LDH释放实验表明，c-MetCAR-T细胞的抗肿瘤作用随着效靶比的增加，杀伤率逐渐增高；当效靶比为20∶1时，杀伤率达到最高，为64.18%。ELISA结果表明，与CD19CAR-T细胞和活化的T细胞相比，在靶细胞刺激下c-MetCAR-T细胞能释放出更多的IL-2和IFN-γ。<br>　　结论：1、c-Met可作为CAR-T细胞疗法治疗结肠癌的分子靶点。<br>　　2、c-MetCAR-T细胞能够靶向识别并杀伤c-Met阳性的结肠癌细胞，同时提高增殖能力和细胞因子释放水平。