检索历史 清除

摘要目的：观察乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase 2, ALDH2）对LPS诱导小鼠血脑屏障和脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells, BMECs）通透性的作用；并探讨线粒体分裂和融合在脑内皮屏障中的潜在机制。<br>　　方法：1）动物实验：C57BL/6J小鼠随机分为4组（每组15只）：正常对照组（Con）、脓毒症组（LPS）、脓毒症+ALDH2激动剂Alda-1组（LPS+Alda-1）、脓毒症+ALDH2抑制剂Daidzin组（LPS+Daidzin）。LPS腹腔注射10 mg/kg/只构建脓毒症模型。神经反射评分、HE染色、脑含水量和伊文思蓝含量观察脑组织损伤。透射电镜观察脑组织病理变化和线粒体形态变化。ATP试剂盒检测线粒体功能，ELISA检测4-HNE含量，MDA、SOD和CAT试剂盒检测氧化应激指数变化。Western blot 检测ALDH2、紧密连接蛋白ZO-1、Occludin蛋白表达以及线粒体融合蛋白OPA1、Mfn2和分裂蛋白Drp1、Fis1表达。<br>　　2）细胞实验：LPS药物干预bEnd.3脑微血管内皮细胞12 h体外模拟脓毒症脑损伤，分组如下所示：正常对照组（Con）、LPS 损伤组（LPS）、LPS+Alda-1 组、LPS+Daidzin组、LPS+线粒体裂变抑制剂组（LPS+Mdivi-1）和LPS+线粒体裂变抑制剂+ALDH2抑制剂组（LPS+Mdivi-1+Daidzin）。CCK8检测细胞活性，跨内皮细胞电阻TEER及FITC-Dextran渗漏检测体外内皮屏障通透性。ELISA检测4-HNE含量，MDA、SOD和CAT试剂盒检测氧化应激指数变化。ATP试剂盒检测线粒体功能，JC-1检测检测线粒体膜电位，Mito Tracker Red检测线粒体形态变化。DHE探针检测细胞内ROS水平，MitoSOX检测线粒体ROS表达水平。Western blot 检测ALDH2、紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin 蛋白表达以及线粒体融合蛋白 OPA1、Mfn2和分裂蛋白Drp1、Fis1表达。<br>　　结果：1）动物实验：与Con组比较，LPS组神经反射评分降低，异常脑组织病理变化、脑含水量及伊文思蓝含量、血清4-HNE、MDA含量增加，而SOD、CAT活性和ATP浓度降低（P＜0.01，P＜0.05）；ALDH2、OPA1、ZO-1和Occludin 蛋白表达降低（P＜0.01，P＜0.05），Drp1、Fis1 蛋白表达升高（P＜0.05）。与 LPS 组比较，LPS+Alda-1组异常脑组织病变、脑含水量及伊文思蓝含量、血清4-HNE、MDA含量均降低，而SOD、CAT活性（P＜0.01）和ATP浓度增高（P＜0.05）；ALDH2、ZO-1、Occludin、OPA1和Mfn2蛋白表达升高，Drp1、Fis1蛋白表达下降（P＜0.01， P＜0.05）；与LPS+Alda-1组相比，LPS+Daidzin组结果相反。<br>　　2）细胞实验：相比于Con组，LPS组细胞活性（P＜0.01）、跨内皮细胞电阻TEER （P＜0.05）、线粒体膜电位JC-1、SOD、CAT活性和ATP浓度降低（P＜0.01）明显降低，而FITC-Dextran渗漏、细胞内和线粒体ROS荧光强度、细胞上清4-HNE、MDA含量表达增加（P＜0.01）；ALDH2、ZO-1、Occludin、OPA1和Mfn2蛋白表达降低，Drp1、Fis1 蛋白表达升高（P＜0.01）。相比于 LPS 组，LPS+Alda-1 和LPS+Mdivi-1组细胞活性、TEER、线粒体膜电位JC-1、SOD、CAT活性和ATP浓度表达增高（P＜0.01），FITC-Dextran 渗漏、细胞内和线粒体 ROS 荧光强度、4-HNE、MDA含量表达均降低（P＜0.01）；ALDH2、ZO-1、Occludin、OPA1和Mfn2蛋白表达升高，Drp1、Fis1表达降低（P＜0.01，P＜0.05）；与LPS+Alda-1组相比， LPS+Daidzin组结果表达却相反。此外，相比LPS +Mdivi-1组，LPS+Mdivi-1+Daidzin组细胞活性、TEER、线粒体膜电位JC-1及SOD、CAT活性和ATP浓度（P＜0.01）明显降低，而FITC-Dextran渗漏、细胞内和线粒体ROS荧光强度、4-HNE、MDA含量表达增加（P＜0.01）；ALDH2、ZO-1、Occludin、OPA1和Mfn2蛋白表达降低， Drp1、Fis1蛋白表达升高（P＜0.01，P＜0.05）。<br>　　结论：1）激动ALDH2可以减少脓毒症相关性脑病氧化应激的产生，维持线粒体的动态平衡，发挥内皮屏障保护作用；<br>　　2）Mdivi-1抑制线粒体裂变可以减少氧化应激的产生，改善LPS诱导脑微血管内皮细胞的通透性；<br>　　3）激动ALDH2发挥对LPS诱导内皮屏障损伤的作用，可能与抑制线粒体裂变有关。