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摘要目的： 构建一种自体乳腺癌细胞来源的，对乏氧肿瘤微环境响应的仿外泌体核酸药物递送系统，用以靶向调控肿瘤转移前生态位的乳腺癌细胞和癌相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）。<br>　　方法：通过差速离心法提取三阴性乳腺癌细胞（triple-negative breast cancer， TNBC）来源的外泌体（exosome，Exo）和非三阴性乳腺癌细胞来源的外泌体，对其粒径、电位及形貌进行表征，特征蛋白的鉴定采用western blot实验，激光共聚焦显微镜（confocal laser-scanning microscope，CLSM）观察正常小鼠体内外泌体的肺组织靶向性。采用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术鉴定两种外泌体的蛋白质成分，对差异蛋白进行生物信息学分析，筛选出靶向肿瘤转移前生态位的相关蛋白，western blot实验进行验证。<br>　　使用热激法构建含有表达整合素基因的重组质粒的生物工程菌，从中提取目的质粒。将目的质粒转染进小鼠乳腺癌细胞（4T1细胞），western blot实验验证质粒转染成功。通过反复冻融法提取转染后的肿瘤细胞膜（engineered tumor cell membrane，iTumor M），对细胞膜的粒径、电位和形貌进行表征。使用CLSM观察iTumor M与4T1细胞和小鼠胚肺成纤维细胞（NIH-3T3）的粘附摄取及在小鼠肺组织内的靶向情况。将iTumor M和脂质体（Liposome）进行融合，对不同组成比例的Liposome-iTumor M的粒径、电位进行表征，使用CLSM观察不同组成比例的Liposome-iTumor M与4T1细胞和NIH-3T3细胞的粘附摄取情况以及对正常小鼠肺组织的靶向性，筛选出脂质体和细胞膜的最佳融合比例。对最佳融合比的Liposome-iTumor M的形貌及膜融合情况进行鉴定。<br>　　1，7-二溴庚烷（1,7-dibromoheptan，DBH）在碱性条件下与乏氧响应基团2-硝基咪唑（2-nitroimidazole，2-NI）连接，得到产物DBH-NI。DBH-NI在碱性条件下与NH2-PEG2000反应，得到PEG-DBH-NI。采用核磁共振氢谱（1H NMR）验证DBH-NI和PEG-DBH-NI的合成。构建不同PEG比例修饰的Liposome-iTumor M，通过对其理化性质的表征以及与胎牛血清孵育后吸附的蛋白量来筛选PEG-DBH-NI的最佳修饰量。紫外光谱分析验证PEG-DBH-NI的乏氧响应性，比较乏氧前后PEG-DBH-NI/Liposome-iTumor M的粒径变化。<br>　　阳离子牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，CBSA）是通过将乙胺修饰到牛血清白蛋白上获得的，双缩脲法确定CBSA的等电点，质谱确定CBSA的分子量并计算修饰的乙胺分子的量。去溶剂法制备鱼精蛋白纳米粒（protamine，PRTM）。通过琼脂糖凝胶电泳检测CBSA或PRTM装载siRNA的能力，对CBSA/siRNA和PRTM/siRNA的粒径、电位及形貌进行表征。<br>　　琼脂糖凝胶电泳筛选脂质体装载siRNA、CBSA/siRNA和PRTM/siRNA的最佳载药方法及载药核心，根据筛选结果把PEG-DBH-NI/Liposome-iTumor M与核心组装成壳核型全载体，对全载体的粒径、电位及形貌进行表征，并对其乏氧响应性进行验证。通过免疫荧光（ Immunofluorescence ， IF ）实验评价载有siCOX-2的该仿外泌体药物递送系统对4T1与NIH-3T3共培养体系细胞的基因沉默能力。<br>　　结果：1.NanoBrook 90Plus Zeta电位及粒度仪显示TNBC和非TNBC来源的两种外泌体的粒径在50-150 nm之间。透射电子显微镜（transmission electron microscope， TEM）显示两种外泌体均为圆球状囊泡。western blot实验表明在两种外泌体中， TSG101和CD9（Exo标志蛋白）均高表达， GRP94（细胞内蛋白）存在较少，验证了外泌体的成功提取。体内肺组织靶向实验表明TNBC来源的外泌体更容易在肺组织中富集。<br>　　2.iTRAQ蛋白质组学技术检测出TNBC相较于非TNBC来源的外泌体共有306个差异表达的蛋白，对这些蛋白进行分析，根据KEGG数据库结果筛选出 ECM-receptor interaction通路中的差异蛋白整合素β1（integrin β1，ITGβ1）。通过western blot验证了TNBC来源的外泌体相较于非TNBC来源的外泌体，表达更多的ITGβ1。<br>　　3.Western blot实验验证转染ITGB1质粒的工程化乳腺癌细胞（engineered 4T1 cells，i4T1）的成功制备。iTumor M的水合粒径为333.52±15.26 nm，电位在-20 mV左右，TEM图像显示其呈圆形的囊泡状结构。体外细胞摄取实验和体内肺组织靶向实验，证实了iTumor M相比Tumor M更容易被肿瘤细胞和成纤维细胞摄取，也更容易靶向粘附到肺组织。<br>　　4.根据融合囊泡（Liposome-iTumor M）的理化性质、细胞摄取实验和肺靶向实验，筛选出脂质体和细胞膜的最佳融合比为2∶1（大豆卵磷脂质量∶细胞膜蛋白质量）。该比例融合得到的Liposome-iTumor M的水合粒径为257.03±5.89 nm，电位为-31.35±0.60 mV，CLSM检测脂质体与细胞膜的成功融合。<br>　　5.核磁共振氢谱检测验证PEG-DBH-NI成功合成。根据不同修饰比的PEG的抗蛋白吸附能力，结合粒径数据，选择10%的PEG为最佳修饰比例。紫外扫描光谱显示乏氧条件下， PEG-DBH-NI的硝基特征峰消失。PEG-DBH-NI/Liposome-iTumor M在乏氧处理后，其水合粒径从175.40±1.86 nm变为 248.74±8.41 nm ，接近于Liposome-iTumor M的水合粒径。以上均验证其乏氧响应。<br>　　6.通过在BSA表面修饰乙胺获得阳离子化程度适中的CBSA，测得CBSA的等电点为8.5，质谱结果显示CBSA的分子量为68278.2656 Da。采用去溶剂法成功制备了PRTM纳米粒，溶液外观呈现淡蓝色，有明显的丁达尔效应。琼脂糖凝胶电泳实验结果表明CBSA、PRTM与siRNA的质量比为30∶1时，siRNA向正极的移动完全被阻滞，提示二者均有很好的siRNA包载能力。<br>　　7.使用脂质体作为模型外壳，根据琼脂糖凝胶电泳实验显示，通过电转染的方法,外壳装载CBSA/siRNA的效果最好。siRNA的质量/CBSA的蛋白质量/外壳的质量=1/30/30时， CBSA/siRNA可以很好地被包裹到外壳中去。构建的 CBSA/siRNA@PEG-DBH-NI/Liposome-iTumor M 纳米粒，粒径为196.16±2.77 nm，电位为-22.49±1.82 mV，TEM图像显示其是一个圆形结构的纳米粒。经过乏氧处理后，粒径变为 259.34±3.23 nm，验证了全载体的乏氧响应性。<br>　　8.Western blot和IF实验验证了与癌细胞共培养后，CAFs成功活化。IF实验表明，与对照组相比，CBSA/siCOX-2@PEG-DBH-NI/Liposome-iTumor M 处理后的4T1和CAFs细胞的COX-2蛋白表达量显著下降。<br>　　结论：成功构建了一种基于自体乳腺癌细胞生物工程化改造的，乏氧响应的仿外泌体核酸药物递送系统（CBSA/siRNA@PEG-DBH-NI/Liposome-iTumor M），可用于对肿瘤转移前生态位的靶向调控。