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摘要研究背景：心血管疾病是一组心脏及血管结构及（或）功能异常的相关疾病，包括但不限于与心肌缺血、心脏畸形、血管栓塞等引起并伴有一系列症状的疾病，例如冠心病、急性心肌梗死等。心血管疾病是全球死亡率最高的疾病。血红蛋白水平与心血管疾病呈U型关系，血红蛋白水平的升高或降低都可能增加心血管疾病的发病率。<br>　　血红蛋白是红细胞的重要组成成分，红细胞的生理功能主要是由血红蛋白完成。血红蛋白与机体的功能活动息息相关，血红蛋白异常时会引发多种疾病，血红蛋白合成过程中的损伤会因氧气供应减少而改变细胞功能并导致贫血性疾病，增加心血管疾病的发病率。除此之外，血红蛋白降低也是心力衰竭患者预后不良的预测指标。而目前对于心血管疾病的研究主要集中于线粒体调控的能量代谢方面，对血红蛋白影响心血管疾病的机制研究甚少。因此，检测血红蛋白可以为心血管疾病风险评估提供一种简便依据，掌握血红蛋白生成的调控机制对于开发新的贫血及心血管疾病疗法非常重要。<br>　　研究目的：研究斑马鱼3号染色体血红蛋白基因敲除降低血红蛋白水平后其心血管发育的变化及可能机制。<br>　　研究内容与方法：（1）利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼3号染色体血红蛋白基因hbba2到hbae3的片段，构建该片段缺失的杂合突变体斑马鱼（Hb+/-），将Hb+/-自交并对其后代进行筛选。为了探究纯合突变体（Hb-/-）缺失的原因，对Hb+/-的分离与遗传传递进行分析，将Hb+/-自交后收集所产胚胎进行基因型鉴定；并将Hb+/-与野生型斑马鱼（WT）正、反交，统计其后代的基因分离比例。<br>　　（2）用杂合突变体作为研究模型，将Hb+/-的心血管发育与WT斑马鱼进行对比，观察并分析两者心血管发育差异。①分别将不同时期的Hb+/-与WT胚胎进行固蓝染色（o-Dianisidine）观察血红蛋白含量及分布；②将Hb+/-与myl7:EGFP转基因斑马鱼杂交统计并分析72hpf心率；③将Hb+/-与kdrl:EGFP转基因斑马鱼杂交观察斑马鱼胚胎血管的发育；④检测5月龄Hb+/-和WT成年斑马鱼红细胞数量并分析差异；⑤用TRIzol法提取Hb+/-和WT成年斑马鱼心脏总RNA进行转录组建库测序，通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）验证Hb+/-和WT斑马鱼中的基因表达差异。<br>　　结果：（1）在成年Hb+/-自交后代斑马鱼中未筛选到Hb-/-。我们首先鉴定了Hb+/-自交胚胎的基因型，WT、Hb+/-、Hb-/-的比值为55:225:2，Hb-/-仅占0.71%，WT:Hb+/-约为1:4，因此排除纯合致死。进一步探究杂合突变体产生配子的比例，将Hb+/-与WT进行正、反交，结果显示Hb+/-雌鱼与WT雄鱼杂交胚胎Hb+/-与WT的比例约为47:1，Hb+/-雄鱼与WT雌鱼杂交胚胎Hb+/-与WT的比例约为2:1，统计结果证明Hb+/-表现出扭曲遗传分离。<br>　　（2）心血管发育观察及结果分析：①o-Dianisidine结果显示，Hb+/-血红蛋白含量明显减少，并且在50hpf的胚胎中观察到其异位分布；②与myl7:EGFP转基因斑马鱼杂交后对72hpf心率统计，发现Hb+/-心动过缓（p＜0.0001）；③与kdrl:EGFP转基因斑马鱼杂交后观察到Hb+/-腹部主血管与共同基静脉均相对WT发育迟缓，而肠下静脉的发育更快，尾部节间血管出现增生；④5月龄Hb+/-和WT成年斑马鱼红细胞计数结果表明两者之间的红细胞数量没有显著差异（p＞0.05）；⑤对成年斑马鱼转录组分析发现，Hb+/-中血红蛋白基因hbba2的表达显著下调，且缺氧诱导基因hif3a也显著下调，而在HIF1信号通路中诱导型一氧化氮合酶编码基因nos2b和NADPH氧化酶2编码基因cybb显著上调，心肌收缩通路中肌钙蛋白T2编码基因tnnt2c显著上调，并且氧化磷酸化通路中复合物Ⅰ-Ⅳ（电子传递链的组成成员）相关基因显著下调，复合物V（ATP合酶）相关基因显著上调。<br>　　结论：血红蛋白基因敲除影响胚胎时期斑马鱼的血红蛋白水平和血管发育，在成年之后通过调控基因表达和线粒体的补偿机制可维持机体的正常生理活动。