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摘要随着排放进入大气中的二氧化碳（CO2）不断增加，海洋吸收大量CO2导致表层CO2分压的上升。这个过程中CO2、H+和HCO3-在海水中浓度增加，导致海水pH值的降低从而造成海洋酸化。海洋酸化会对海洋生物的生理和行为造成巨大影响。下丘脑作为神经内分泌器官，在鱼类应激后能合成并且释放促肾上腺皮质激素释放激素（Corticotropin-releasing-hormone,CRH），其对于维持内稳态具有重要作用。应激发生时，CRH作为神经内分泌的关键因素，广泛分布在中枢神经系统，主要集中在下丘脑，在应激调节中起着重要作用并调控HPI轴活性。CRH和促肾上腺激素释放激素结合蛋白（Corticotropin-releasing-hormonebindingprotein,Crhbp)、促肾上腺激素释放激素I型受体（Corticotropin-releasing-hormonereceptor1，Crhr1）统称为CRH系统，能够调节内分泌和应激反应。在应激发生时，鳃同样可以感受环境胁迫分泌CRH。同时鳃上分布大量酸碱离子转运体，能进行酸碱平衡调节，维持细胞内外酸碱离子浓度平衡。本文以模式生物海水青鳉（Oryziamelastigma）为实验对象，目的是测试海水青鳉CRH系统对海水酸化的响应，并进行一系列实验。<br>　　本论文主要分为三大部分：第一部分采用免疫组化检测鳃上Crh蛋白，荧光定量PCR（qPCR）对CRH系统相关基因crh,crhbp,crhr1以及对酸碱平衡离子通道相关基因nhe3,rhcg1,ae1进行检测，探究急性酸化应激（2h，4h）对青鳉鱼鳃的CRH系统和酸碱平衡离子通道的影响；第二部分是免疫组化检测下丘脑中Crh蛋白，qPCR检测CRH系统相关基因，探究急性酸化应激（2h、4h）对青鳉鱼脑部的CRH系统的影响；第三部分是进行Crh免疫组化、Western-Blot蛋白定量，使用高效液相色谱质谱联用仪（LC-MS）进行皮质醇浓度测定，qPCR检测CRH系统相关基因。探究慢性酸化应激7d对青鳉鱼脑部CRH系统和HPI轴的影响。<br>　　1.急性酸化应激（2h，4h）对青鳉鱼鳃的CRH系统和酸碱平衡离子通道的影响<br>　　将青鳉鱼分为对照组（440ppmCO2）、1000ppmCO2和1800ppmCO2酸化组，维持pH值在8.3±0.1（440ppmCO2）、7.9±0.1（1000ppmCO2）和7.6±0.1（1800ppmCO2）。与对照组相比，酸化2h后，鳃小片末端检测到Crh蛋白，在鳃弓鳃丝和鳃耙尚并未检测到Crh蛋白表达信号。鳃小片末端上Crh信号主要的分布于细胞质中。对照组没有检测到明显的Crh蛋白表达信号；酸化4h后，鳃小片末端同样检测到Crh蛋白表达信号，信号主要的分布于细胞质中以及细胞外，细胞外的分泌信号主要呈点状分布。CRH系统相关基因crh,crhbp,crhr1的表达也受到酸化影响，三者的表达量随着酸化浓度的升高而升高。<br>　　qPCR检测酸碱平衡离子通道相关基因Na+/H+离子转运体（Na+/H+exchanger3,Nhe3)、Rh家族C糖蛋白1（RhfamilyCglycoprotein,Rhcg1)、阴离子转运体1b（Anioexchanger1b,Ae1b)。酸化4h后ae1bmRNA表达量下降，rhcg1mRNA表达量随着酸化浓度的升高而降低。酸化2h，随着酸化浓度升高nhe3mRNA表达量先升高后降低。相反，酸化4h后随着酸化浓度的升高其表达量先降低后升高。本章节表明，海洋酸化能导致鳃上CRH系统激活，并且分泌Crh蛋白响应海洋酸化，同时酸化影响酸碱平衡离子通道相关基因的表达。<br>　　2.急性酸化应激（2h，4h）对青鳉鱼脑部CRH系统的影响<br>　　根据免疫组化结果显示，酸化组和对照组相比Crh信号分布没有明显差异，只有下丘脑中叶具有Crh细胞外分泌信号，可能存在分泌Crh的昼夜节律因此具有少量细胞外分泌信号。结果表明，海水青鳉在应对急性酸化应激时，下丘脑并未激活CRH系统。<br>　　3.慢性酸化应激7d对青鳉鱼脑部CRH系统和HPI轴的影响<br>　　HPI轴是调节鱼类机体内稳态的一个重要神经分泌通路，应激激活下丘脑中具有CRH分泌功能的神经元，使下丘脑分泌CRH诱导垂体分泌促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropichormore,ACTH)，ACTH进入到肾间质中诱导产生糖皮质激素皮质醇，皮质醇是HPI轴的终末产物能对应激进行内稳态调控。为探究青鳉鱼CRH系统对慢性酸化应激7d的响应情况，进行了酸化7d的酸化实验。结果表明，酸化7d后，与对照组相比，酸化处理组下丘脑前叶、中叶和后叶均检测到Crh细胞质内信号以及细胞外分泌信号，对照组信号位置主要位于细胞外。Western-Blot实验结果发现酸化后Crh蛋白表达量升高，这表明酸化7d后下丘脑激活CRH系统并且分泌Crh。相反，crh、crhbp、crhr1的mRNA表达量以及皮质醇浓度随着酸化浓度的升高而显著下降。<br>　　综合以上结果，我们发现，急性酸化应激能引起鳃的Crh分泌并且进行局部内稳态调节，这时候下丘脑并未参与到对应激的响应。同时，酸化也能引起鳃酸碱平衡离子通道相关基因mRNA的变化。酸化7d后下丘脑CRH系统被激活，CRH神经元分泌Crh并且激活HPI轴进行负反馈调节。