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摘要铜绿假单胞菌是一种常见的食物或水传播病原体，其内在的抗生素耐药性导致感染患者的高死亡率。持留菌是在抗生素治疗后存活下来的耐受亚群，是细菌的一种表型变异。铜绿假单胞菌持留菌可引起尿路感染、烧伤皮肤感染和肺部感染等疾病反复发作，这也是慢性感染难以治愈的主要原因。若反复使用抗生素，持留菌可能进化为耐药菌。持留水平高的菌株会迅速替代持留水平低的菌株，持留会逐渐演变为群体耐受。而耐受增加了耐药突变的传播机会，为耐药快速进化铺平了道路。<br>　　目前耐药持留菌的治疗方法主要包括化学方法（如抗生素联合疗法和新药开发）、物理方法（如纳米材料和LED照明控制）以及生物方法（如噬菌体疗法）。抗生素在农业、畜牧业、临床等方面的广泛使用造成环境中耐药菌与临床耐药菌问题的出现，比如破坏细菌种群群落结构，威胁人类公共健康等。在病人治疗时使用物理方法比如纳米材料控制持留菌时，可能影响体内细胞稳态，需要严格把控其生物安全。与这些传统的抗菌方法相比，噬菌体具有显著的优点，如噬菌体的特异性及自限性。但是当细菌进入持留状态，其细胞膜发生变化，代谢水平降低，噬菌体是否还能侵染细菌？λ噬菌体能够裂解大肠杆菌，待大肠杆菌持留菌转为正常生长状态的细菌，噬菌体裂解基因表达导致细菌死亡。基于此，推测目前筛选的两株噬菌体能够侵染铜绿假单胞菌持留菌，噬菌体吸附在持留菌上，待持留菌恢复正常生长状态时，噬菌体相关基因表达上调并裂解持留菌，最终达到去除铜绿假单胞菌持留菌的目的。为了验证这一猜想，进行了噬菌体对铜绿假单胞菌持留菌的控制规律和机制的研究。这有助于进一步了解噬菌体与持留菌间的相互作用以及进化过程；其次，更好地了解噬菌体在控制持留菌生长过程中发挥的作用机制。<br>　　本研究利用高滴度的噬菌体侵染氧氟沙星筛选出的铜绿假单胞菌持留菌（MOI=100），探讨侵染过程和机制。结果发现：噬菌体够感染特定的细菌，因此可以作为生物控制剂来控制细菌引起的动物、植物和人类感染性疾病。在这项研究中，两株可以侵染铜绿假单胞菌的同源噬菌体（名为PPAY和PPAT）被分离出来并进行了表征。观察噬菌斑发现，PPAT的噬菌斑形状是透明的小点，而PPAY的噬菌斑是带有光环的半透明斑块。透射电子显微镜结果显示，PPAT（65nm）和PPAY（60nm）菌株在尺寸上相似，并且都由一个二十面体的头部和一个较短的尾巴组成，属于短尾噬菌体科（Podoviridae）。一步生长曲线显示PPAT和PPAY的潜伏期为20min，爆发时间为30min。PPAT的爆发大小（953PFU/cell）高于PPAY（457PFU/cell）。同样，PPAT在5min时的吸附速率常数（5.97x10-7mL/min）也高于PPAY（1.32x10-7mL/min）。进行噬菌体的全基因组测序分析发现，PPAT和PPAY的基因组分别为54,888bp和50,154bp。同源性和进化分析表明，PPAT和PPAY与PA11密切相关。在PPAY中存在尾部纤维蛋白，而在PPAT中没有，这可能是PPAY噬菌斑的环状效应产生的原因。总之，本文筛选出的PPAT和PPAY都是一种新的感染铜绿假单胞菌的裂解性噬菌体，二者同源。两株噬菌体均显示出对细菌的生长抑制作用，这有助于治疗细菌感染，可用于研究和临床目的。<br>　　本课题建立了稳定的铜绿假单胞菌持留菌的筛选模型，采用氧氟沙星抗生素来筛选持留菌，筛选时间为12h，持留率约为0.01%。通过透射电镜观察到持留菌比正常菌普遍要长，表面蛋白含量多，更容易形成生物膜。通过转录组分析，铜绿假单胞菌PAO1进入持留后，细胞通过影响群体感应信号分子C4-HSL、Pel多糖合成、藻酸盐生成、鞭毛运动等形成生物膜，给持留菌搭建一个“保护屏障”。此外，细菌能量代谢降低，调节外膜蛋白抵抗抗生素渗入细胞，增加存活机会。持留菌PA0610（prtN）等基因的表达比正常菌显著升高，促进结合蛋白产生，从而调节细菌的生长、代谢，适应环境应激。其中prtN编码绿脓杆菌素激活蛋白，调节绿脓杆菌素的生成，是影响持留菌持留率的关键基因。<br>　　噬菌体能够裂解大部分持留菌（菌量从105CFU/mL左右下降至102CFU/mL左右），但是需要的时间比裂解正常细菌的时间长。噬菌体吸附在持留菌上，当抗生素去除时，能够杀死持留菌。噬菌体一次爆发后吸附在无噬菌体感染的持留菌上，进行下一轮新的侵染。在12h时，与初始相比，PPAT加入后PAO1持留菌（平板上菌量）的存活率约5×10-5，PPAY加入后PAO1持留菌（平板上菌量）的存活率约1×10-4。在12h时，与初始相比，PPAT加入后PAO1?prtN持留菌（平板上菌量）的存活率约1×10-3，PPAY加入后PAO1?prtN持留菌（平板上菌量）的存活率约0.5×10-3。<br>　　在PPAT控制PAO1持留菌的过程中，主要是通过调控ATP的合成促进持留深度及通过影响胞内过氧化氢酶含量调控复制过程，最终导致细胞膜破损，细菌被裂解死亡。PPAY对PAO1持留菌的控制主要通过ATP降低促进深度持留，细胞膜破损，最终细菌被裂解。噬菌体对PAO1?prtN持留菌的控制效果较差。PAO1?prtN持留菌可能通过调节绿脓杆菌素生成及藻酸盐和鞭毛等的合成，影响噬菌体的吸附。细菌的prtN基因可能影响其噬菌体抗性进化过程，对细菌与噬菌体的共同进化有重要影响。持留率升高后，PPAT对PAO1?prtN持留菌的控制水平降低，PPAY控制PAO1?prtN持留菌依赖于SOD升高产生的过氧化氢升高，对细胞膜的破坏性增强。噬菌体可以有效地控制持留菌生长，侵染并裂解持留菌或者吸附在持留菌上，通过提高胞内过氧化氢酶等基因表达促进子代噬菌体复制进程，从而杀灭持留菌。本研究分析了噬菌体对铜绿假单胞菌持留菌的控制效果及相关机制，研究结果为有效控制耐药持留菌及慢性感染的治疗提供理论与技术支撑。