检索历史 清除

摘要目的：分析MB组织与正常小脑组织中circRNA的表达谱，筛选目标circRNA并分析该circRNA的下游靶基因及目的蛋白，验证筛选出的circRNA_103128对MB细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力以及凋亡情况等细胞表型的影响，从而证实circRNA_103128通过调控miR-129-5p/SOX4信号通路影响髓母细胞瘤生物学功能。<br>　　方法：1.提取MB与正常小脑组织的临床标本中的RNA样本，使用ArraystarHumancircRNAArrayV2芯片进行分析，检测样本中circRNA的相对表达量，随后将MB与正常小脑组织中circRNA表达量进行对比，从中筛选出差异性较大的circRNA_103128作为实验对象，构建circRNA_103128敲减细胞模型和空载对照模型，随后提取细胞模型的RNA，使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术验证细胞模型中circRNA_103128表达水平。<br>　　2.构建可抑制circRNA_103128且带有抗嘌呤霉素标记的慢病毒以及空载病毒，转染MB细胞系Daoy并使用嘌呤霉素进行筛选，敲低Daoy细胞系中circRNA_103128的表达量，随后使用qRT-PCR技术验证Daoy细胞WT株、Daoy细胞SH株和Daoy细胞NC株的circRNA_103128表达水平，最后通过细胞平板克隆形成实验、CCK-8细胞增殖实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验和细胞凋亡流式实验，分别从增殖能力、迁移能力、侵袭能力和细胞凋亡情况等方面验证circRNA_103128表达量的改变是否会造成Daoy细胞生物学功能的改变。<br>　　3.使用Arraystar基于TargetScan和miRanda的靶点预测软件预测可以与circRNA_103128相互作用的下游microRNA（miR-129-5p），随后使用qRT-PCR技术验证circRNA_103128对miR-129-5p的调控。<br>　　4.在先前的实验中，我们以通过Targetscan、miRTarbase和miRDB等生信网站筛选出并使用蛋白质免疫印迹法（WesternBlot，WB）验证了miR-129-5p的下游目的基因-SOX4基因。在本实验中，我们将再次对比MB肿瘤组织以及正常小脑组织中SOX4蛋白的表达量，并进一步验证SOX4蛋白在Daoy细胞中是否受circRNA_103128的调控，最后使用免疫荧光技术观察MB组织与正常小脑石蜡切片中SOX4的表达差异情况以再次验证先前结论。<br>　　5.构建miR-129-5p的抑制剂抑制Daoy-SH株的miR-129-5p，构建Daoy-SH+Inhibitor株，观察能否逆转circRNA_103128敲低后造成的Daoy细胞生物学功能改变，并验证下游SOX4蛋白的表达情况。<br>　　6.使用Daoy-NC株与Daoy-SH株构建裸鼠皮下成瘤模型，观察、记录肿瘤生长情况并在处死模型裸鼠后称量肿瘤重量，验证circRNA_103128是否在动物模型上依旧存在影响。<br>　　结果：1.利用ArraystarHumancircRNAArrayV2芯片分析3对正常组织与MB肿瘤组织circRNA的相对表达量，共筛选出533个差异表达的circRNA，从中选取在MB组织标本中明显高表达的circRNA_103128作为研究对象，随后再次用qRT-PCR技术进行验证，证实芯片预测结果，既MB组织中circRNA_103128的表达量明显超过正常小脑组织，差异有统计学意义。<br>　　2.转染慢病毒的Daoy-SH株细胞的增殖、迁移及侵袭水平较Daoy-WT株与Daoy-NC株均受到不同程度的抑制，而其凋亡水平增加。<br>　　3.利用生物信息预测软件预测出的下游miR-129-5p基因的表达随着circRNA_103128的敲低显著上升，证明circRNA_103128确实可以参与miR-129-5p的调控。<br>　　4.SOX4蛋白在肿瘤组织中明显高表达，免疫荧光实验也证实这一现象，并且在抑制Daoy细胞的circRNA_103128表达情况后SOX4的表达也随之受到抑制。<br>　　5.在使用miR-129-5p的抑制剂后，Daoy-SH株被抑制的恶性表型再次恢复，Daoy-SH+Inhibitor株的增殖、迁移及侵袭水平较Daoy-SH株增强，凋亡水平降低，且这些生物学功能与Daoy-NC株接近。<br>　　6.在构建裸鼠皮下成瘤模型后1月后观察，相比于接种Daoy-NC株的裸鼠模型，接种Daoy-SH株的裸鼠的皮下肿瘤模型生长受到明显的抑制，再次验证了circRNA_103128可以促进肿瘤的发生发展。<br>　　结论：对比MB组织与正常小脑组织中的circRNA表达量，筛选出MB组织中明显高表达的circRNA_103128作为实验对象，利用慢病毒构建circRNA_103128下调的人MB细胞系Daoy细胞模型Daoy-SH株进行实验，发现circRNA_103128可利用分子海绵机制与下游miR-129-5p相互作用，从而调节下游的SOX4蛋白在MB细胞中的表达量，下调circRNA_103128后可使得Daoy细胞的增殖能力、迁移能力以及侵袭能力遭到抑制，同时诱导Daoy细胞凋亡。circRNA_103128/miR-129-5p/SOX4这一调控通路或许可为今后MB的诊断与治疗提供新的方向。