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摘要本课题拟通过临床试验以观察评价其有效性与安全性，并设计动物实验予以进一步验证，同时运用代谢组学分析技术以预测其潜在作用机制，后续再通过分子生物学技术进行验证，深入探讨益肾通络方治疗肾虚络阻型少弱精子症的作用机制。本课题分为以下2个部分，共4项研究：<br>　　第一部分 益肾通络方治疗肾虚络阻型少弱精子症不育患者的疗效评价<br>　　目的：<br>　　评价益肾通络方治疗肾虚络阻型少弱精子症不育患者的有效性与安全性，提供益肾填精、活血通络法改善肾虚络阻型少弱精子症临床疗效的循证医学证据。<br>　　方法：<br>　　本研究为单中心、随机化、对照的临床试验，选取2022年1月至2022年12月于河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院）生殖医学科门诊就诊的符合试验标准的肾虚络阻型少弱精子症不育患者108例。采用SAS9.3软件产生随机编码，按1:1将纳入患者随机分配到试验组与对照组，各为54例。试验组给予益肾通络方，对照组给予左卡尼汀口服溶液，疗程均为90天，并于治疗开始前、30天、60天、90天及治疗结束后3个月各随访1次。主要疗效指标包括精子浓度、精子总数、PR百分率、PR＋NP百分率及配偶受孕率；次要疗效指标包括精液量、中医症候评分。安全性指标包括血尿常规、肝肾功能、心电图等，于入组前和用药结束后各检查一次。每次随访时填写病例报告表，记录各类不良事件，严格评估脱落、剔除情况，最后进行统计分析，客观评价其临床疗效。<br>　　结果：<br>　　本研究共纳入患者108例，试验组54例，对照组54例。研究期间，共剔除、脱落7例，其中试验组脱落4例，对照组剔除、脱落3例，最终以试验组50例，对照组51例，共计101例完成临床观察且资料完整，被纳入统计。<br>　　1.主要疗效指标：（1）精液质量主要参数：组内比较，与治疗前相比，试验组与对照组治疗后精子浓度、精子总数、PR精子百分比、PR+NP精子百分比均显著改善(P＜0.001)。治疗后组间比较，试验组的精子浓度、精子总数、PR精子百分比、PR+NP精子百分比提升均优于对照组(P＜0.001)。（2）配偶受孕率：试验组受孕率为20.00%，对照组受孕率为13.73%，两组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。<br>　　2.次要疗效指标：（1）精液量：组内比较，与治疗前相比，试验组治疗后精液量有所提升(P＜0.05)，对照组的精液量提升不明显(P＞0.05)。治疗后组间比较，与对照组相比，试验组在提升精液量方面无统计学差异(P＞0.05)。（2）中医症候评分：组内比较，与治疗前相比，试验组各次访视的中医症候评分总分均降低(P＜0.05)，对照组各次访视在降低中医症候评分总分方面均无统计学差异(P＞0.05)。同时期组间比较，试验组三次访视在降低中医症候评分总分方面均明显优于对照组(P＜0.01)。中医症候单项积分比较，试验组在改善腰膝酸软，小腹、腹股沟或会阴部刺痛，头晕，耳鸣，性欲减退，神疲乏力，舌色紫黯，舌有瘀点或瘀斑，舌下脉络增粗，脉沉迟或涩等症状上疗效显著，组内均具有统计学差异(P＜0.05)，而在改善夜尿频多或余沥不尽的症状上随着用药时间延长也有效果；对照组第三次访视（90±5天）与基数资料期（0-7天）相比，在腰膝酸软、头晕、耳鸣、神疲乏力的症状方面有改善(P＜0.05)，其余症状随着用药时间延长仍无明显改善(P＞0.05)。<br>　　3.安全性评价：试验组与对照组的所有患者在研究期间均未出现明显不良反应，服药结束后复查血尿常规、肝肾功能以及心电图等安全性指标均未出现明显异常。<br>　　4.临床疗效结果：试验组总有效率为88.00%；对照组总有效率为66.67%，益肾通络方的治疗效果优于左卡尼汀口服溶液(P＜0.05)。<br>　　结论：<br>　　益肾通络方在提升精子浓度、精子总数，提高PR精子百分比、PR+NP精子百分比，以及在改善临床症状等方面，均优于左卡尼汀口服溶液，能提高配偶受孕率，且未见明显不良反应，表明益肾通络方治疗肾虚络阻型少弱精子症不育患者安全有效。<br>　　第二部分 基于代谢组学及AMPK/mTOR通路探讨益肾通络方调控肾虚络阻型少弱精子症模型大鼠睾丸生精细胞凋亡与自噬的作用机制<br>　　目的：<br>　　1.构建肾虚络阻型少弱精子症的病证结合大鼠模型，并观察益肾通络方对肾虚络阻型少弱精子症模型大鼠的影响。<br>　　2.运用非靶向代谢组学筛选益肾通络方调控肾虚络阻型少弱精子症的差异代谢物并进行代谢通路分析，预测益肾通络方治疗肾虚络阻型少弱精子症的潜在作用机制。<br>　　3.基于AMPK/mTOR信号通路，从生精细胞凋亡与自噬的角度，探讨益肾通络方治疗肾虚络阻型少弱精子症的具体作用机制。<br>　　方法：<br>　　1.观察各组大鼠一般状态、体重变化、睾丸与附睾重量及其脏器系数，检测各组大鼠精子质量、凝血功能，光镜和透射电镜下分别观察各组大鼠睾丸与附睾组织病理形态学改变、睾丸组织细胞超微结构变化。<br>　　2.以大鼠睾丸组织、血清为研究对象，基于液相色谱与质谱联用分析技术，获得各组大鼠睾丸组织及血清的代谢轮廓，主要采用主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析，筛选差异代谢物，并进行代谢通路富集分析。<br>　　3.通过透射电镜观察大鼠睾丸组织细胞超微结构变化，采用TUNEL法检测各组大鼠睾丸组织细胞凋亡率，免疫组化法、WB检测各组大鼠睾丸组织中p-mTOR、p-AMPK、Cleaved Caspase-3、Caspase-3、Bcl-2、Bax、p62、Beclin1、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的蛋白表达量以及RT-qPCR技术检测各组大鼠睾丸组织中mTOR、AMPK的mRNA表达水平。<br>　　结果：<br>　　1.模型大鼠的精子浓度和精子总活力均显著下降(P＜0.001)，凝血功能指标中PT、TT缩短(P＜0.05)，而FIB显著增加(P＜0.001)，同时观察到模型大鼠出现肾虚络阻型相关症状与表现，睾丸、附睾组织病理形态学观察可见较多微血管内有瘀血。<br>　　2.益肾通络方发挥治疗肾虚络阻型少弱精子症的睾丸组织与血清样本潜在生物标志物各有25个、134个，主要涉及丁酸甲酯代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、甘油磷脂代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、鞘磷脂代谢、氨酰基tRNA生物合成及半乳糖代谢、磷酸肌醇代谢、抗坏血酸和藻酸盐代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、嘧啶代谢、苯丙氨酸代谢、花生四烯酸代谢等代谢通路。基于上述结果分析，推测益肾通络方治疗肾虚络阻型少弱精子症与调控睾丸生精细胞凋亡、自噬活动密切相关，最终选取AMPK/mTOR途径作为下一步分子机制研究通路，揭示益肾通络方治疗肾虚络阻型少弱精子症的作用机制。<br>　　3.与GTW+A组比较，益肾通络方各剂量组大鼠睾丸组织细胞凋亡率均显著降低(P＜0.001)；免疫组化、WB结果显示，益肾通络方各剂量组大鼠睾丸组织中Bax、Cleaved Caspase-3、Beclin1、p-AMPK蛋白表达量均低于GTW+A组(P＜0.05)，GTW+A+YSTLF-M组、GTW+A+YSTLF-H组大鼠睾丸组织中Bcl-2、p62、p-mTOR蛋白表达量均高于GTW+A组(P＜0.05)，GTW+A+YSTLF-H组大鼠睾丸组织中的Cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表达量比值及LC3Ⅱ蛋白表达量均低于GTW+A组(P＜0.05)；RT-qPCR结果显示，益肾通络方各剂量组大鼠睾丸组织中的AMPK mRNA表达水平均降低(P＜0.05)，GTW+A+YSTLF-H组大鼠睾丸组织中的mTOR mRNA表达水平显著高于GTW+A组(P＜0.001)。综上，GTW+A+YSTLF-H组的调控作用最强。<br>　　结论：<br>　　1.通过40mg/(kg·d)GTW灌胃4周，联合0.3mg/(kg·d)A皮下注射1周（实验第4周）以及隔日注射A2h后再将大鼠置于冰水环境10min的造模方法，可致模型大鼠睾丸、附睾组织损伤，引起其精子浓度和精子活力的下降，同时观察到模型大鼠出现肾虚络阻型相关症状，凝血功能指标PT、TT降低以及FIB升高，睾丸、附睾微血管内可见瘀血，表明肾虚络阻型少弱精子症的病证结合模型构建成功。<br>　　2.益肾通络方能改善肾虚络阻型少弱精子症模型大鼠中医证候相关症状，调节凝血功能，修复睾丸、附睾的部分损伤，改善微血管内瘀血状态，提高模型大鼠的精子浓度和精子活力，再次验证了益肾通络方治疗肾虚络阻型少弱精子症的有效性与安全性。<br>　　3.代谢组学技术是探索益肾通络方作用机制的有效手段，益肾通络方可能通过调控生精细胞凋亡与自噬活动发挥治疗肾虚络阻型少弱精子症的作用，且可能与AMPK/mTOR途径有关。<br>　　4.益肾通络方可降低大鼠睾丸组织的细胞凋亡率，下调Bax、Cleaved Caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ、p-AMPK的蛋白表达和Cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表达量比值，以及AMPK mRNA表达，而上调Bcl-2、p62、p-mTOR的蛋白表达，以及mTOR mRNA表达，提示益肾通络方可能通过AMPK/mTOR信号途径抑制睾丸生精细胞的过度凋亡与自噬活动，发挥治疗肾虚络阻型少弱精子症的作用。<br>　　综上，益肾通络方可有效提高肾虚络阻型少弱精子症不育患者的生殖机能，临床疗效明显，且具有良好的安全性，其作用机制可能是通过AMPK/mTOR信号途径调控睾丸生精细胞凋亡与自噬而实现的。