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摘要目的：<br>　　采用宏基因组学和代谢组学技术，探索孕期恐应激致抑郁情绪跨代传递的肠道微生物机制，为从微生物角度阐释中医孕期恐伤肾致子代情志异常的理论提供实验依据。<br>　　方法：<br>　　1. 以旷场实验为基线测试，选取基线一致的 SPF级 11周龄、体重 190± 20 g的 Wistar大鼠 45只（雌鼠 30只、雄鼠 15只），以雌：雄=2：1的比例合笼交配。12 h后根据阴栓法或阴道涂片法检测雌鼠受孕情况，取孕 0.5 d的雌鼠 24 只，按随机数字法分为正常组和恐应激两组（n=12），完成交配的雄鼠作为电击鼠用于恐应激造模。恐应激组孕鼠在妊娠第 1-19 d 采用课题组改良的旁观电击法，给予每日 1 次、每次 30 min 的恐应激造模；正常组孕鼠放置在相同的造模环境中，不给予恐刺激。采用场景恐惧实验评价孕鼠恐应激造模效果，自然出生的仔鼠每窝随机取两只，延续母鼠的分组。使用旷场实验、糖偏好实验评价孕仔鼠抑郁样行为；ELISA 实验检测孕仔鼠血清 ACTH、GC水平评价抑郁状态。采用强迫游泳实验评价仔鼠抑郁样行为。<br>　　2. 采集孕 20 d雌鼠及 7 w仔鼠粪便，采用宏基因组学测序分析母子两代肠道微生物基因数据。使用 PCoA 及物种组成分析，分别比较母子两代组间的微生物组成结构。通过 LEfSe 筛选母子两代肠道微生物紊乱的关键差异菌种及具有共同变化趋势的共差异菌种。使用 Spearman 相关性分析，探索共差异菌种与仔鼠关键差异菌种的联系。使用 HUMAnN3 分析母子两代微生物功能，结合 LEfSe 筛选每一代关键的差异微生物功能及母子两代具有共同变化趋势的微生物通路。<br>　　3. 使用非靶向代谢组学检测孕仔鼠肠道代谢物，通过 OPLSA-DA分析，比较组间母子两代的代谢物组成。基于 ORA 分析每一代显著改变的差异代谢通路，结合差异微生物功能，筛选两代差异微生物代谢通路及具有共同变化趋势的共差异微生物代谢通路。通过 Spearman 相关性分析，探索共差异菌种与仔鼠微生物代谢功能紊乱的联系。<br>　　4.进一步探究恐应激仔鼠前额叶皮质（prefrontal cortex，PFC）中抑郁相关分子变化，结合宏基因与非靶向代谢组学数据，使用高效液相色谱法测定仔鼠 PFC 中与共差异微生物代谢通路相关的甘氨酸、丝氨酸含量，以及与抑郁相关的单胺类神经递质，氨基酸类神经递质，使用 ELISA 法检测 PFC 中炎性细胞因子含量。使用 Spearman 相关性分析，探索以上指标与共差异菌种及共差异微生物代谢通路的联系，评价恐应激影响下微生物垂直传播、微生物跨代效应与部分抑郁相关分子的关系。<br>　　结果：<br>　　1. 孕期恐应激模型制备效果评估及孕仔鼠抑郁情绪评价<br>　　与正常组相比，恐应激组孕鼠场景恐惧实验中的冻结时间显著升高（P＜0.05），提示造模成功；恐应激组孕仔鼠糖偏好实验的蔗糖偏好、旷场实验的中央区域停留时间与进入中央区域次数均显著降低（P＜0.05），恐应激组仔鼠强迫游泳实验的不动时间显著增加（ P＜0.05 ）。与正常组相比，恐应激组孕仔鼠血清 ACTH、GC水平均显著升高（P＜0.05）。<br>　　2. 孕期恐应激改变孕仔鼠肠道微生物组成结构与微生物功能<br>　　通过 PCoA 与不同水平的物种组成分析，两组间的母子两代肠道微生物组成结构有显著差异（P＜0.05）。LEfSe 筛选关键差异菌种，与正常组相比，恐应激组仔鼠有 138 种关键差异菌种（LDA＞2，P＜0.05），恐应激组孕鼠有87 种，其 中 7 种共差异 菌种在 恐应激后 母子两 代中均显 著增 加（ uncultured_Prevotella_sp.、Bacteroides zhangwenhongi、Myoviridae sp.、Ruminococcus bovis、uncultured bacterium、Bacteroides nordii 与Duncaniella sp.C9）。相关性网络图显示这些共差异菌种与子代关键差异菌种间有广泛且密切的相关性。微生物功能方面，与正常组相比，恐应激组子代显著改变的功能通路有 44 条（LDA＞2，P＜0.05），母代有 32 条（LDA＞2， P＜0.05），母子两代均显著改变的有 4 条（LDA＞2，P＜0.05），其中硫辛酸代谢、MAPK 信号通路和近端小管碳酸氢盐功能均显著降低，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢均显著增加。<br>　　3. 孕期恐应激改变孕仔鼠的代谢物及代谢物功能<br>　　OPLS-DA 与关键代谢物分析显示，恐应激后母子两代的代谢物组成均具有显著差异（P＜0.05）。差异代谢功能方面，与正常组相比，恐应激组母子两代均有 29 条差异代谢通路（P＜0.05）。结合宏基因组学微生物功能数据，与正常组相比，恐应激组仔鼠显著差异（P＜0.05）的微生物代谢通路有 7 条，孕鼠有 5条，其中共差异微生物代谢通路（甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢）在恐应激后母子两代中均显著增加（P＜0.05）。相关性分析显示，7 种共差异菌种与仔鼠显著改变的微生物代谢功能有广泛联系。<br>　　4. 共差异菌种及代谢功能与仔鼠 PFC抑郁相关分子的关联分析<br>　　基于 KEGG 中 map00260 通路图分析发现，共差异微生物代谢通路中所测的代谢物与丝氨酸合成及转换相关。与正常组仔鼠相比，丝氨酸和与之相互转换的甘氨酸在恐应激组仔鼠 PFC 中含量显著增加（P＜0.05）。此外，与正常组仔鼠相比，恐应激组仔鼠氨基酸类递质γ-氨基丁酸（ gamma-aminobutyric acid，GABA）、谷氨酸水平显著减少（P＜0.05）；单胺类神经递质去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）显著增加，多巴胺（dopamine， DA）、5-HT 含量显著减少（P＜0.05）；炎性因子 IL-1β、TNF-α 显著增加（P＜0.05）。通过相关性分析显示共差异菌种、微生物功能与抑郁相关的分子可组成相关性网络，其中 Myoviridae sp.、uncultured bacterium、Bacteroides nordii、Duncaniella sp. C9、Choline、L-Cystathionine、丝氨酸、甘氨酸、NE、TNF-α、IL-1β组成密集的相关性模块。<br>　　结论：<br>　　1. 孕期恐应激可诱导母子两代均出现抑郁情绪，伴随显著的微生物紊乱及微生物功能紊乱，且母子间存在共同变化特征。恐应激影响的微生物紊乱可通过垂直传播至子代，这可能是孕期恐应激致仔鼠抑郁的肠道生物学基础。<br>　　2. 恐应激可诱导母子两代代谢物及代谢物功能紊乱，且母子间存在共同变化特征。恐应激导致的孕鼠微生物紊乱可通过垂直传播至子代，恐应激母子两代共差异微生物及微生物紊乱介导的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢异常跨代效应可能是导致子代抑郁的关键机制。<br>　　3. 孕期恐应激可导致仔鼠 PFC 多种抑郁相关分子改变，而微生物与这些分子显著相关，其中与炎性细胞因子联系较密切。