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摘要背景：<br>　　早产（Preterm birth，PTB）是妊娠满28周至不满37足周间分娩者，与婴幼儿多种疾病的发病和死亡密切相关。发达国家的早产率约为5~13%，且存在逐渐增加的趋势，其中自发性早产约占70%。迄今，自发性早产的发病机制尚不明确，宫内感染被认为是自发性早产的主要因素，感染主要来源于下生殖道逆行感染、血行感染、周围脏器粘膜传播及医源性感染。解剖意义上的母胎界面，即蜕膜组织包括蜕膜细胞、滋养细胞以及免疫细胞等，并且蜕膜存在微生物，主要来源于阴道菌群逆行感染。免疫细胞在母胎界面构建的微环境在免疫耐受、妊娠维持乃至分娩发动中起到至关重要的作用。正常妊娠时，母胎界面的巨噬细胞通过促进滋养细胞的侵袭，参与子宫螺旋动脉的重铸，亦可吞噬凋亡细胞等方式伴随妊娠维持以及分娩发动。滋养细胞通过侵袭和内分泌功能参与妊娠过程。既往研究表明母胎界面中免疫稳态失衡，可导致炎症相关因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17、IL-21以及IL-22等异常上调。炎症因子上调可导致滋养细胞凋亡，进而引起胎膜早破、慢性胎盘早剥、胎盘梗死等，并与自发性早产密切相关。M1与M2型巨噬细胞比例的异常升高，与流产、子痫前期等妊娠相关疾病有关。目前对于感染性早产母胎界面菌群构成的特征，是否影响巨噬细胞极化状态以及滋养细胞的凋亡尚未进行深入研究。<br>　　目的：<br>　　本研究拟从“母胎界面微生态-巨噬细胞极化-滋养细胞凋亡”的角度出发，通过检测感染性早产母胎界面菌群构成的特征及差异；观察母胎界面巨噬细胞极化状态与局部炎症因子的变化；探索局部炎症因子改变与滋养细胞凋亡的相关性；探究滋养细胞凋亡的可能机制，为感染性早产的有效预测和防治提供理论依据。<br>　　方法：<br>　　1、选取2019年1月~2021年12月期间，在南京医科大学第一附属医院分娩的40例自发性早产孕妇（32.67±2.47周）作为研究组，足月分娩的41例孕妇（39.21±0.99周）作为对照组。分析血常规结果及胎盘组织病理学特征；采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测蜕膜组织中细菌的绝对丰度；通过对细菌16S rRNA基因V3-V4区域的扩增和高通量测序对孕妇蜕膜组织进行菌群分析。<br>　　2、采用10×Genomics单细胞转录组测序检测蜕膜组织中的细胞亚群，巨噬细胞的分型，计算M1与M2巨噬细胞的比例；分析M1和M2显著表达的基因；并通过GO功能富集分析探究M1和M2巨噬细胞的生物功能。利用免疫荧光染色验证蜕膜组织中巨噬细胞的分型及比例。通过RT-PCR检测蜕膜组织中炎症因子（hASC、Nlrp3、NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-3、IL-10及IL-12）相关基因的表达。通过TUNEL染色检测胎盘滋养细胞的凋亡。<br>　　3、用无乳链球菌GBS感染RAW. 264.7巨噬细胞系24小时后观察巨噬细胞系的形态变化；采用流式细胞仪检测巨噬细胞M1和M2的分子标记；RT-PCR检测细胞中炎症因子基因表达水平（IL-1β，IL-6、TGF-β，IL-10）。ELISA法检测上述细菌和巨噬细胞共培养24小时后的细胞上清液中炎症因子（IL-1β、IL-6）的蛋白表达水平。分别将细胞上清液与滋养层细胞系（HTR8-S/Vneo细胞）或者细胞上清、IL-6抑制抗体与HTR8-S/Veno细胞（IL-6 IP组）共培养24小时后，通过细胞增殖毒性检测法（CCK-8试剂盒）检测滋养细胞的增殖情况；流式细胞仪检测HTR8-S/Vneo细胞的凋亡率。<br>　　4、培养人类胎盘原代滋养层细胞（Primary Human Cytotrophoblast，PHT），用100 ng/mL的IL-6刺激原代滋养层细胞。通过Annexin V/PI双染色后利用流式细胞仪测定原代滋养层细胞的凋亡率；CCK-8法检测滋养细胞的增殖情况；免疫蛋白印迹法（Western blot）检测凋亡相关蛋白质如BCL-2和BAX的表达水平，以及相关通路蛋白p-JAK2和p-STAT3的表达水平。<br>　　结果：<br>　　1、比较临床基本资料，多因素Logistic回归分析发现胎膜早破（OR_adjusted=16.49）、孕期阴道出血（OR_adjusted=4.65）、孕期口腔炎症（OR_adjusted=5.92）、孕期阴道炎（OR_adjusted=12.02）、孕期被动吸烟（OR_adjusted=4.38）等是早产的危险因素（OR＞1，P＜0.05）；而孕期体重增加为保护性因素（OR_adjusted=0.61，P＜0.05）。研究组分娩前外周白细胞总数显著升高（研究组10.77±3.13*109/L、对照组9.37±2.25*109/L，P=0.025）；中性粒细胞计数（研究组8.56±2.97*109/L、对照组6.56±1.52*109/L）及比率（研究组78.18±7.17%、对照组70.13±5.22%）均显著高于对照组P＜0.001；淋巴细胞比率（研究组15.00±5.54%、对照组20.01±4.89%）及单核细胞比率（研究组6.00±1.94%、对照组7.22 ±1.90%）存在显著差异（P＜0.0001、P=0.005）。相较于对照组，研究组淋巴细胞计数降低（研究组2.09±3.56*109/L、对照组2.63 ±3.36*109/L）；单核细胞计数升高（研究组0.80±1.06*109/L、对照组0.69± 0.24*109/L），但差异无统计学意义（P＞0.05）。胎盘病理结果提示：研究组胎盘炎3例（7.5%）；胎膜炎21例（52.50%）；同时发生胎盘及胎膜炎16例（44%）；其中合并脐血管炎1例。对照组发生胎盘炎2例、胎膜炎3例、胎盘及胎膜炎1例。研究组胎盘炎症反应显著增加，P＜0.05。<br>　　2、研究组蜕膜组织细菌的绝对丰度显著高于对照组（每微升样本中细菌总载量的对数值：研究组为4.20±0.88；对照组为2.98±0.40，P＜0.0001）。两组菌群多样性分析无组内及组间显著性差异（P＞0.05）；非参数检验和线性判别分析(LDA)：研究组和对照组蜕膜组织存在显著差异的菌属：研究组中厚壁菌门Firmicutes、芽孢杆菌纲Bacilli富集；对照组变形菌门Proteobacteria、γ-变形菌纲Gammaproteobacteria、伯克霍尔德菌Burkholderia、伯克氏菌科burkholderiaceae和雷尔氏菌Ralstonia富集。<br>　　3、研究组和对照组蜕膜组织中细胞亚群类型总体上一致，均由B细胞、滋养层细胞、蜕膜细胞、内皮细胞、绒毛外滋养细胞、肌成纤维细胞、自然杀伤细胞NK细胞和T细胞以及巨噬细胞构成；但两组中各细胞亚群的构成比略有不同（研究组vs对照组）：B细胞（1.20%vs 0.23%）、滋养层细胞（11.31%vs 3.91%）、蜕膜细胞（11.08%vs 7.70%）、内皮细胞（4.45%vs 1.94%）、绒毛外滋养细胞（33.38%vs 33.30%）、肌成纤维细胞（1.31%vs 0.66%）、NK细胞和T细胞（1.59%vs 2.09%）。研究组巨噬细胞的构成比（M1+M2）低于对照组（30.1%vs 49.2%）。蜕膜组织巨噬细胞M1/M2比例升高（研究组M1/M2=1.08，对照组 M1/M2=0.30，P＜0.05）。M1型巨噬细胞高表达IL1β，LYZ，S100A8， CXCL8，NFKBIA等基因，M2型高表达LYVE1、F13A1、SELENOP、DAB2、MRC1等基因；GO功能富集分析表明：M1型巨噬细胞中差异上调的基因功能富集如：细胞因子正向调控、T细胞活化、T细胞增殖调控、Toll样受体、IL-6分泌正向调控等。M2型巨噬细胞差异上调的基因功能富集如：细胞黏附正向调控、ERK1/2丝裂原活化蛋白激酶级联、TGF-β的反馈、生长发育正向调控等。免疫荧光染色研究组蜕膜组织M1/M2显著升高（M1/M2，研究组1.86，对照组0.35，P=0.009）。RT-PCR检测研究组蜕膜组织中hASC、Nlrp3、NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子基因差异表达的倍数分别为2.2、3.4、2.2、2.3、3.3和6.2；基因相对表达量显著升高（P＜0.05）；IL-3、IL-10、IL-12等无显著变化（P＞0.05）。TUNEL染色检测蜕膜组织滋养细胞相对凋亡率，研究组为1.99%，对照组为1.12%，两组存在显著差异P＜0.01。<br>　　结论：<br>　　1、感染性早产与母胎界面菌群失衡密切相关，正常胎盘母胎界面存在独立的低丰度微生物群组。<br>　　2、母胎界面巨噬细胞M1型极化增加与局部炎症因子产生相关。<br>　　3、母胎界面炎症因子异常增高促进滋养细胞凋亡与感染性早产有关。