检索历史 清除

摘要研究目的：<br>　　长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNA）与包括肺腺癌在内的多种肿瘤的发生发展相关，深入发掘与肺腺癌相关lncRNAs的作用具有重大意义。据报道ZBED5-AS1与卵巢癌患者的总体生存率相关，但在其他疾病中的作用尚不清楚。我们发现ZBED5-AS1在肺腺癌胸水外泌体中高表达，因此本研究旨在探讨lncRNA ZBED5-AS1在肺腺癌中的生物学作用以及相关机制。<br>　　研究方法：<br>　　1. 基因芯片分析良恶性胸腔积液外泌体中差异表达的lncRNAs。<br>　　2. 超速离心法提取肺腺癌细胞上清中的外泌体，并通过透射电子显微镜和免疫蛋白印迹技术（western blotting ，WB）进行外泌体鉴定。<br>　　3. 实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测肺腺癌组织、癌旁组织和肺腺癌细胞中ZBED5-AS1的表达水平；分析组织标本与临床病理关系。<br>　　4. 慢病毒构建 ZBED5-AS1 稳定表达的过表达和敲低细胞株，并通过RT-qPCR验证转染效率。<br>　　5. 通过细胞增殖实验、凋亡实验和集落形成实验观察肺腺癌细胞的增殖能力；Transwell实验观察细胞迁移和侵袭能力的变化；WB技术检测E-cadherin、N-cadherin、vimentin、snail和slug等上皮-间质转化（ Epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关蛋白标志物的表达变化；裸鼠成瘤实验验证ZBED5-AS1在体内的作用。<br>　　6. 通过转录组测序、查阅文献推测以及细胞功能学实验和挽救实验验证ZBED5-S1的下游mRNA以及相关通路。<br>　　7. 使用RT-qPCR检测肺腺癌细胞相关外泌体中ZBED5-AS1表达水平；外泌体共培养实验研究ZBED5-AS1对肺腺癌细胞侵袭和集落形成能力变化。<br>　　研究结果：<br>　　1. 基因芯片结果显示相对于肺炎，在肺腺癌胸腔积液外泌体中有177个上调，215个下调的差异表达lncRNAs，其中ZBED5-AS1表达上调3.003倍。<br>　　2. 透射电镜图可以看到外泌体为圆盘状，且根据标尺直径大约为100 nm，符合外泌体直径在30-150 nm之间的特征；WB技术验证外泌体特征蛋白CD9和TSG101为强阳性，而阴性蛋白Calnexin不显示；以上表明我们提取的外泌体是合格的。<br>　　3. RT-qPCR结果表明ZBE5-AS1在肺腺癌组织和细胞株中高表达；组织中ZBED5-AS1的表达水平和临床病理特征没有明显的相关性。<br>　　4. 用慢病毒成功构建稳转细胞株后，体外细胞功能学实验表明ZBED5-AS1可以促进肺腺癌细胞的增殖迁移以及EMT相关进展；体内裸鼠成瘤实验表明ZBED5-AS1可以促进肿瘤的大小和生长速度。<br>　　5. 通过细胞功能学实验、挽救实验以及WB技术确定ZBED5-AS1是通过下游mRNA ZNF146激活ATR/CHK1信号通路而促进肺腺癌的发展。<br>　　6. 与正常肺支气管上皮细胞（BEAS-2B）和对照组相比，从肺腺癌细胞和过表达ZBED5-AS1的肺腺癌细胞提取出来的外泌体中的ZBED5-AS1明显高表达；将低表达ZBED5-AS1的外泌体与肺腺癌细胞共培养，明显抑制细胞的侵袭和集落形成能力。<br>　　研究结论：<br>　　LncRNA ZBED5-AS1通过下游mRNA ZNF146激活ATR/CHK1通路来促进肺腺癌细胞的增殖迁移和侵袭。