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摘要目的<br>　　1.从转录层面水平探讨RSVA亚型(RespiratorysyncytialvirusAsubtype,RSV-A)毛细支气管炎的宿主遗传与免疫反应特点，深化对RSV感染发病机制的认识。<br>　　2.寻找能客观评价RSV-A毛细支气管炎疾病严重度的特异性生物学指标，为分子诊断和早期干预提供科学依据。<br>　　方法<br>　　1.研究对象：为2021年7月1日-2022年7月1日因临床诊断毛细支气管炎在温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院呼吸科住院，符合纳入标准及排除标准的RSVA亚型毛细支气管炎患儿作为病例组，按病情分为轻度组、中度组及重度组，同时招募同期于儿童保健科体检的健康儿童作为对照组；收集病例组和对照组的一般资料，病例组的临床和实验室资料。<br>　　2.研究方法：入院24小时内采集毛细支气管炎患儿鼻咽分泌物标本，采用直接免疫荧光法筛查RSV抗原，对RSV阳性样本进行RNA提取、反转录、扩增目的基因、琼脂糖凝胶电泳检测、条带回收、测序及序列比对分析流程鉴定亚型；48小时内收集病例组及对照组的全血标本进行外周血白细胞RNA的提取，将病例组及对照组合格的RNA外送RNA测序（RNA-Sequencing,RNA-seq）获取测序结果。<br>　　3.生物信息技术分析<br>　　3.1利用R软件中的limma包检测病例组与对照组的差异表达基因（Differentiallyexpressedgenes，DEGs），同时采用生物学功能富集及PPI网络的构建的方法分析，寻找和免疫相关的通路和关键的免疫基因。<br>　　3.2将轻度组、中度组、重度组分别与对照组比较，筛选差异表达基因；将病例组所有表达基因的数据作为数据集，利用加权基因共表达网络分析（Weightedgeneco-expressionnetworkanalysis,WGCNA）方法寻找与疾病严重度相关的基因共表达模块，通过生物学功能富集的方法筛选能客观评估RSV-A毛细支气管炎疾病严重度的生物学指标。<br>　　4.统计学分析：采用非参数Mann-WhitneyU检验或χ2检验进行组间比较。<br>　　结果<br>　　1.RSV亚型鉴定<br>　　扩增产物琼脂糖凝胶电泳、核苷酸序列及正反向核苷酸序列测序部分峰形显示为RSVA亚型。<br>　　2.病例组与对照组一般资料<br>　　病例组共有44例患儿，其中男28例（63.6%），女16例（36.4%），男女比1.75:1.00，中位年龄6.5月龄（3个月～11个月），＜6月龄19例（43.2%），≥6月龄25例（56.8%）。对照组有20例儿童，其中男12例（60.0%），女8例（40.0%）,男女比1.50:1.00，中位年龄5.5月龄（3个月～9个月）。病例组和对照组的年龄（Z=0.437，P=0.662）及性别（χ2=0.078,0.781）差异均无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性。<br>　　3.病例组的疾病严重度<br>　　轻度组19例（43.2%）,中度组14例（31.8%）及重度组11例（25.0%）。<br>　　4.病例组的差异基因表达筛选及分析<br>　　4.1病例组与对照组的DEGs筛选<br>　　与对照组比较，病例组共有DEGs1282个，其中上调基因837个（65.29%），下调基因445个（34.71%）。<br>　　4.2DEGs进行基因本体（GeneOntology，GO）数据库、京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG）富集分析<br>　　DEGs的GO功能分析，其参与的生物过程(biologicalprocess，BP)主要包括通过质膜黏附分子的细胞-细胞黏附等。KEGG通路富集结果显示，主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞黏附分子、钙离子信号通路等免疫相关信号通路。其中细胞因子-细胞因子受体相互作用通路富集了38个DEGs,如白介素-1β（Interleukin1beta，IL-1β），白介素-10（Interleukin10，IL-10），CC亚家族趋化因子配体2（CCChemokineligand2，CCL2）等。<br>　　4.3DEGs的蛋白质互相作用（Protein-ProteinInteraction,PPI）网络构建<br>　　共有12个基因处于PPI网络的核心位置，对整个网络起的作用最为关键。鉴定出IL-1β、IL-10、CCL2、表皮生长因子受体（Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）、Toll样受体2（Toll-likereceptor2，TLR2）、基质金属蛋白酶9（Matrixmetalloprotein-9，MMP-9）为参与免疫应答相关的基因。<br>　　5.病例组与疾病严重度相关的生物学指标分析与鉴定<br>　　5.1轻、中、重度组与对照组的DEGs筛选<br>　　轻、中、重度组与对照组比较得到的DEGs分析显示：轻度组DEGs995个，中度组DEGs1139个，重度组DEGs1123个；其中轻、中、重度组共有相同表达基因261个。<br>　　5.2获取与轻、中、重度相关联的模块及分析<br>　　blue模块与临床表型相关性较高（r＝0.34，P＜0.05），与疾病严重度表型存在相关性。对该模块模块中的基因进行PPI网络分析，并筛选出前15个核心基因。其中，与疾病严重度关联度较大的基因为伴侣蛋白含T复合物蛋白1,亚基5（ChaperonincontainingT-complexprotein1,subunit5,CCT-5）和β肌动蛋白（Actinbeta，ACTB）。blue模块中基因的GO功能富集显示在生物学过程中主要涉及中性粒细胞激活、中性粒细胞脱颗粒等生物学免疫相关过程。KEGG通路富集结果显示，主要富集在过氧化物酶体、碳代谢等相关信号通路。<br>　　结论<br>　　1.EGFR、TLR2、MMP-9及有IL-1β、IL-10、CCL2参与的细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路在RSVA亚型毛细支气管炎的宿主免疫应答发挥作用。<br>　　2.CCT-5和ACTB可能是预测RSVA亚型毛细支气管炎疾病严重度的生物学标志物。<br>　　3.中性粒细胞激活及脱颗粒可能参与RSVA亚型毛细支气管炎的宿主免疫应答。