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摘要目的：<br>　　本研究旨在揭示一种新型氨基糖苷类抗菌药物修饰酶APH(9)-Ic的功能，该酶能使氨基糖苷类药物被磷酸化而失效。我们在临床分离菌株嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）142、156中分别发现了新型氨基糖苷类抗菌药物修饰酶基因aph(9)-Ic、aph(9)-Ic1。通过基因克隆、药敏试验、重组蛋白表达、酶动力学参数分析、逆转录荧光定量实时PCR（RT-qPCR），验证了aph(9)-Ic的耐药性功能。经过全基因组测序，运用进化树构建、基因周围环境分析、氨基酸多序列比对的方法，确定aph(9)-Ic及其变体的分子特征和遗传背景。新型氨基糖苷抗菌药物修饰酶的发现，有助于我们解释在微生物种群中日渐庞杂的耐药机制。<br>　　方法：<br>　　1.在2015年期间，收集温州医科大学附属第二医院临床实验室标本中分离得到的病原菌，经医院实验室初步的MALDI-TOF质谱鉴定，在细菌基因组测序的基础上，与公共数据库现有的原核生物基因组数据比较，计算平均核苷酸相似度（ANI）分析细菌的种属。<br>　　2.采用琼脂稀释法开展体外药敏试验，测定菌株对临床广泛使用的β-内酰胺类药物和氨基糖苷类抗菌药物的耐药性和最小抑菌浓度（MIC）。<br>　　3.利用HiSeq2500测序平台和PacBio RSⅡ三代测序平台进行细菌全基因组测序，利用生物信息学软件进行序列拼接与注释全基因组的开放阅读框（ORFs）及蛋白质的功能。<br>　　4.对基因组测序结果进行耐药性基因注释，结合细菌耐药谱分析细菌耐药性基因型与耐药表型的关系。<br>　　5.利用BPROM在线工具1预测候选基因的启动子区域，利用SnapGene软件设计相应的引物，高保真酶PCR扩增并对PCR产物进行克隆，琼脂稀释法测定预测耐药性基因的功能。<br>　　6.进行预测耐药性候选基因开放阅读框的PCR扩增，以pCold I为载体进行PCR产物的克隆，进而以BL21为宿主菌进行新型耐药性基因编码蛋白的表达。在16℃，200rpm，20h条件下，用1mM终浓度IPTG诱导大量表达目的重组蛋白。SDS-PAGE确定是否表达正确蛋白后，使用镍柱亲和层析法纯化蛋白质，再用EK酶去除His6-tag，最后用BeyoGoldTM His-tag Protein Purification Kit去除蛋白溶液中的EK酶和小分子His6-tag。测定APH(9)-Ic酶对大观霉素的酶动力学活性。<br>　　7.分别提取经过和不经过一定浓度抗菌药物处理的细菌培养物总RNA，通过逆转录PCR和实时荧光定量PCR对菌株进行新型耐药性基因表达量分析。设计新型耐药性基因定量PCR（qPCR）引物，以16S rRNA基因作为内参进行qPCR反应，分析经抗菌药物诱导和未经诱导的新型耐药性基因表达量的差异。<br>　　8.对新型耐药性基因的起源、与之相关的序列的多态性和结构进行分析，对与耐药性基因相关的序列进行基因组比较分析，预测与耐药性相关的活性功能区域。<br>　　结果：<br>　　1.结合医院实验室初步的MALDI-TOF质谱鉴定结果和实验室细菌基因组测序、ANI分析（菌株142与嗜麦芽窄食单胞菌NCTC1025(NZ_LS483377.1)ANI一致性为98.36%，菌株156与栖木槿假单胞菌ATCC19867(GCF_000382065.1)ANI一致性为97.22%），菌株142和菌株156都是嗜麦芽窄食单胞菌。<br>　　2.嗜麦芽窄食单胞菌142完整基因组仅含有1个染色体，大小为4,830,983bp，编码序列（CDSs）4,378个，其中编码蛋白基因4,350个（99.36%）。嗜麦芽窄食单胞菌156基因组片段（114个contig）总长度4,427,356bp，编码序列（CDSs）3,988个，其中编码蛋白基因3,945个（98.92%）。<br>　　3.体外药物敏感性实验显示菌株142和156对庆大霉素、头孢吡肟、美罗培南、氨曲南和多粘菌素B耐药，对妥布霉素、左氟沙星和氯霉素敏感。在头孢他啶的抗性水平上存在差异，菌株142敏感，而菌株156耐药。在没有CLSI和U.S.FDA给出确定MIC参考值的药物里，菌株142和156表现出对大观霉素、链霉素、核糖酶素和巴龙霉素等药物较高的MIC值。<br>　　4.细菌耐药性基因型与耐药表型的关系分析发现，嗜麦芽窄食单胞菌142和嗜麦芽窄食单胞菌156虽然对大观霉素高度耐药，但是它们基因组注释结果没有发现已知功能的与大观霉素耐药性相关的耐药性基因，进一步的分析发现，它们基因组编码有预测的可能与大观霉素耐药性相关的基因，分别命名为aph(9)-Ic（嗜麦芽窄食单胞菌142）和aph(9)-Ic1（嗜麦芽窄食单胞菌156）。<br>　　5.对aph(9)-Ic和aph(9)-Ic1及其启动子区域序列进行克隆，得到转化子aph(9)-Ic-pMD19-T/DH5α和aph(9)-Ic1-pMD19-T/DH5α，与对照菌株pMD19-T/DH5α和DH5α相比，在抗菌药物敏感性试验中，两个转化子对大观霉素的MIC值分别有8倍和4倍的上升，初步说明aph(9)-Ic和aph(9)-Ic1具有耐药活性，为新型的氨基糖苷类耐药性相关基因。<br>　　6.APH(9)-Ic的酶动力学检测结果显示，APH(9)-Ic对大观霉素具有较高的催化效能，Kcat/Km=(5.58±0.31)×104M-1·s-1，对链霉素无催化活性。<br>　　7.aph(9)-Ic基因全长1,041bp，编码346个氨基酸，其蛋白质大小为38.43k Da，蛋白质等电点是pH6.57；aph(9)-Ic1基因全长1,005bp，编码334个氨基酸，其蛋白质大小为37.12kDa，蛋白质等电点是pH5.61。系统进化树和多序列比对结果显示APH(9)-Ic与已知的APH(9)-Ia、APH(9)-Ib的亲缘关系最接近，是APH(9)-I亚类家族的一个新成员。<br>　　8.aph(9)-Ic和aph(9)-Ic1在大观霉素诱导和不诱导的情况下，进行逆转录-定量PCR（RT-qPCR）分析它们的表达水平，以16S rRNA基因为内参，结果发现诱导细菌1小时后，aph(9)-Ic和aph(9)-Ic1基因表达量有显著增加，分别上升了8.95倍和4.08倍。<br>　　9.经生物信息学分析，aph(9)-Ic基因周围环境无可移动遗传元件（MEG）。<br>　　结论：<br>　　1.本研究报道了菌株142的全基因组序列，并首次报道了编码新型氨基糖苷类磷酸转移酶基因aph(9)-Ic及其变体aph(9)-Ic1。<br>　　2.APH(9)-Ic（或APH(9)-Ic1）与目前已知功能的氨基糖苷类修饰酶氨基酸序列相似度均＜80%，与APH(9)-Ia的相似性最高，为33.75%，可被划分为APH(9)-I亚家族的一个新成员。<br>　　3.酶动力学实验和药敏试验结果证实了APH(9)-Ic有耐药功能活性。与APH(9)-I家族中的其他成员一样，APH(9)-Ic对大观霉素有磷酸化活性。<br>　　4.通过RT-qPCR实验发现，在大观霉素的诱导作用下，菌株142中aph(9)-Ic和菌株156中aph(9)-Ic1表达量上调，差异具有统计学意义。<br>　　5.通过生物信息学分析，aph(9)-Ic上下游10kb结构中未发现目前已知的任何MGE，可认为其基因周围环境较稳定。