检索历史 清除

摘要目的：<br>　　阐明斯氏普罗威登斯菌 P14 的完整全基因组序列特征，了解其耐药情况，分析新型耐药性基因的进化关系、周围环境以及传播机制，并对其编码的蛋白质的功能进行表征。<br>　　方法：<br>　　1.将 2021 年分离自温州市某医院的临床样本的细菌分离接种于 LB 固体培养基，纯化后保种。<br>　　2.对分离纯化后的菌株进行革兰染色和显微镜检，提取基因组 DNA用于全基因组测序和后续耐药性基因的克隆实验。<br>　　3.应用 Illumina NovaSeq和 PacBio RS Ⅱ平台对细菌进行二代和三代测序，使用生物信息学软件对细菌基因组的测序结果进行拼接，利用16S rRNA基因序列和平均核苷酸一致性（ANI）对细菌进行种属鉴定，预测并注释全基因组的开放阅读框（ORFs），预测耐药性基因并分析其周围序列结构以及是否存在可移动遗传元件等。<br>　　4.使用 BPROM在线工具预测耐药性基因的启动子区域，利用 SnapGene软件设计基因的引物，根据注释结果对预测的耐药性基因 aadA36 进行克隆，通过 PCR 扩增 aadA36基因及其上游启动子区域序列，与 pUCP20 载体连接后转化到大肠埃希菌DH5α感受态中，对克隆的基因进行测序，测序结果与原始菌株斯氏普罗威登斯P14菌基因组编码的耐药性基因序列比对验证插入片段是否正确。<br>　　5.根据美国临床和实验室标准协会（CLSI，2021 版）以及欧洲药敏试验委员会（EUCAST，2021 版）推荐的琼脂平板稀释法测定斯氏普罗威登斯 P14 菌株和克隆菌株（pUCP20-aadA36/DH5α）等的药物敏感性以及耐药水平。<br>　　6.将 aadA36 基因的开放阅读框连接到冷休克表达载体 pCold I 上，再转化至宿主大肠埃希菌 BL21 中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导其蛋白表达。<br>　　SDS-PAGE确定其表达后，使用 BeyoGoldTM-His-tag Purification Resin纯化粗蛋白，用凝血酶酶切去除 His 标签后，利用紫外分光光度法在 340 nm 条件下测定 AadA36对多种氨基糖苷类抗生素的酶动力学活性。<br>　　7.利用生物信息学分析 aadA36基因的来源、周围环境及其相关序列的结构，进行耐药性基因相关序列的比较基因组学分析、耐药性相关活性功能区域预测。<br>　　8.对原始菌株 P14 携带的质粒进行注释和比较分析，用肉汤法进行接合转移实验验证其是否可接合转移。<br>　　结果：<br>　　1.16S rRNA基因序列同源性分析发现菌株 P14与 NCBI数据库中斯氏普罗威登斯 ATCC 29914 （NR_024848）菌株的同源性最高（覆盖度为 97.14%, 一致性为99.73%），同时平均核苷酸一致性（ANI）分析显示，P14 菌株和斯氏普罗威登斯菌 ATCC 33672 （NZ_CP008920.1）的相似度最高，为99.24%，因此确定 P14为斯氏普罗威登斯菌（Providencia stuartii）并命名为斯氏普罗威登斯菌 P14（Providencia stuartii P14）。<br>　　2.基因组测序表明菌株 P14 全基因组由一个染色体和两个质粒（pP14-166 和pP14-114）组成，染色体大小约为 4.37 Mb，有 3,967 个编码序列（CDSs），其中功能已知蛋白 2,636 个；质粒 pP14-166 大小约 166 Kb，有 200 个编码序列（CDSs），其中功能已知蛋白 54 个；质粒 pP14-114 大小约为 114 Kb，有 130 个编码序列（CDSs），其中功能已知蛋白48个。<br>　　3.药物敏感性实验显示原始菌株 P14 对所测定的 25 种抗生素中的 16 种，包括大观霉素、链霉素、新霉素以及核糖霉素等都具有耐药性。此外，与对照菌株（pUCP20/DH5α、DH5α）相比，重组菌株（pUCP20-aadA36/DH5α）对大观霉素和链霉素的MIC值分别有128倍和64倍的上升，说明aadA36基因具有耐药活性。<br>　　4.酶动力学检测结果显示，AadA36对大观霉素和链霉素有特定的修饰活性；对妥布霉素不具有修饰活性。对大观霉素和链霉素的催化效率（kcat/Km）分别为（1.07 ± 2.23） × 104 M?1 s?1 和 （8.96 ± 1.01）× 103 M?1 s?1。<br>　　5.aadA36基因位于 P14菌株的染色体上，全长 843 bp，编码长度为 280个氨基酸的 AadA36 酶，其分子量大小为 31.74 kDa，预测等电点为 5.03。系统进化分析显示 AadA36与功能已知蛋白 AadA14的同源性最为接近, 一致性为 51.92%， 覆盖度为83.57%；其次为 AadA31 蛋白， 一致性为 51.28%，覆盖度为 83.57%。AadA36 与ANT (3")-Ia亚类的其他 22条氨基酸序列的多序列比对发现 AadA36含有 6个与腺苷化大观霉素以及链霉素的保守的氨基酸功能残基(E104、W129、D199、N202、W190和D195)。<br>　　6.aadA36 基因上下游各 10 kb 序列与其他三株斯氏普罗威登斯菌和一株未定种的普罗威登斯菌的比较基因组分析发现 aadA36基因周围存在可移动遗传元件 IS200，且其两侧有两对 9 bp和一对 10 bp的不完美反向重复序列。<br>　　7.pP14-166为可接合转移质粒，通过肉汤法可将其接合转移至大肠埃希菌 C600。该质粒携带了15个耐药性基因，比较分析显示，该质粒上存在三个多重耐药区域，且这些耐药性基因均与可移动遗传元件相关。<br>　　结论：<br>　　1.本研究在一株斯氏普罗威登斯 P14 菌株的染色体上发现了 1 个编码新型氨基糖苷腺苷转移酶的基因，将其命名为aadA36。<br>　　2.aadA36 编码的氨基糖苷腺苷转移酶 AadA36 与目前功能已知的氨基糖苷类修饰酶相似度均＜55%，其中与 AadA14和 AadA31的氨基酸序列同源性最高，分别为51.91%和 51.28%，因此，AadA36可以被认为是 ANT (3'''')-Ia亚类中一个新的成员。<br>　　3.药物敏感性试验和酶动力学分析实验结果发现 AadA36与 ANT (3'''')-Ia亚类中的酶的底物谱一致，对大观霉素和链霉素有特定的腺苷化修饰作用，而对其他氨基糖苷类抗生素无修饰活性，进一步确认可将 AadA36 划分为 ANT (3'''')-Ia 的一个新的分支。<br>　　4.基因周围环境分析显示 aadA36基因与一个编码转座酶的插入序列 IS200相关，这提示了该新型耐药性基因在不同种类的细菌间有水平转移的可能性。<br>　　5.质粒 pP14-166 上的三个多重耐药区均与可移动遗传元件相关，且相关耐药性基因在其他种属细菌的质粒上也存在，说明这些耐药性基因可以在不同种属的细菌之间进行传播。