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摘要目的<br>　　临床抗感染治疗时细菌对碳青霉烯类药物的耐药性随着这类药物的广泛使用而越来越强，其危害不容小觑。在碳青霉烯类药物的抗性中，金属酶起着举足轻重的作用。本研究从温州市养殖场的污水中分离得到一株耐碳青霉烯药物的香味菌P34，并发现了P34菌株染色体上编码的一个新型金属β内酰胺酶基因blaWUS-1。我们通过分子克隆、药敏实验及酶动力学分析确定了该基因的功能，并进一步通过全基因组测序和比较基因组分析阐明blaWUS-1基因相关序列的结构和遗传背景。我们期待本研究能为芳香菌属细菌的耐药分子机制研究提供有价值的信息。<br>　　方法<br>　　1.收集2016年和2017年期间从浙江省温州市养殖场污水分离出的菌株。<br>　　2.根据鉴定流程，挑取不同形态、颜色的菌落进行纯化培养，挑选单菌落进行革兰染色、镜检、生化鉴定。同时结合16SrRNA基因序列的同源性比较及全基因组序列的平均核苷酸相似度（ANI）的计算结果确定细菌的种属。<br>　　3.对菌株P34进行全基因组测序，拼接测序结果后进一步预测基因组编码的开放阅读框（ORFs），并进行功能注释，预测耐药性基因，分析其周围是否存在可移动遗传元件及可能的水平转移机制。<br>　　4.根据美国临床和实验室标准协会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI）的指南CLSIM100（2021版），采用琼脂平板稀释法对P34菌株的药物敏感性和耐药水平进行测定。P34菌株的碳青霉烯酶表型检测通过mCIM和eCIM试验进行。<br>　　5.利用SnapGeneViewer设计blaWUS-1的引物并进行基因克隆，克隆成功的插入序列进行测序，与原始菌株P34中相对应的耐药基因序列通过BLASTN进行比对验证，使用琼脂平板稀释法测定克隆菌株的药物敏感性。<br>　　6.克隆新基因blaWUS-1至表达载体pColdI，受体菌为大肠埃希菌BL21（DE3），通过SDS-PAGE检测IPTG诱导后蛋白表达情况，富集融合蛋白，使用凝血酶去除6-His标签得到分离纯化的酶蛋白并进行酶动力学分析。<br>　　7.通过生物信息学软件分析blaWUS-1基因的来源及进化、多态性、序列结构和周围环境。<br>　　8.对多重耐药质粒pMA84474的多重耐药区进行多序列比较分析，研究耐药基因的多态性和进行水平转移的可能性。<br>　　结果<br>　　1.16SrRNA基因同源性比对表明该菌株与MyroidesalbusBIT-d1（MK734183.1）同源性最高，其覆盖度和相似度均为100%；ANI分析结果表明，该菌株与MyroidesalbusBIT-d1Scaffold1（NZ_WMJX01000001）相似度最高，综合16SrRNA基因同源性分析、ANI分析和生化鉴定结果，确定该菌株的种属为Myroidesalbus，并将其命名为MyroidesalbusP34。<br>　　2.药物敏感性测定结果显示，P34对碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类、四环素、氨基糖苷类和链霉素均表现为耐药，mCIM和eCIM测试（mCIM测试和eCIM测试的区域直径差为14mm）呈阳性反应，提示产金属β-内酰胺酶。与对照菌株（DH5α、pUCP24/DH5α）相比，重组菌株pUCP24-blaWUS-1/DH5α对羧苄西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉维酸、亚胺培南、美罗培南的MIC值有不同梯度的上升，克隆株的耐药活性不能被克拉维酸、他唑巴坦和舒巴坦抑制。标准菌（ATCC25922）的MIC值均在控。<br>　　3.菌株P34基因组由大小为3,701,500bp的染色体和一个大小为3,701,500bp的环形质粒组成，染色体GC含量为34.18%，编码3,218个编码序列（CDSs）。质粒pMA84474平均GC含量为31.07%，编码95个编码序列（CDSs），多重耐药区由1个氨基糖苷类耐药基因（aadS）、2个大环内酯类耐药基因（ereD和ermF）、2个β-内酰胺耐药基因（blaOXA-347和blaMYO-1）、1个磺胺类耐药基因（sul2）和一系列密集分布的可移动遗传元件组成。<br>　　4.WUS-1对头孢唑林和头孢西丁的催化效率低，效率最高（kcat/Km为10.06μM?1·s?1）的是氨苄西林。羧苄西林的催化效率（1.93μM?1·s?1）低于碳青霉烯类。β-内酰胺酶抑制剂活性由IC50（50%抑制浓度）显示，乙二胺四乙酸（EDTA）对WUS-1的活性有抑制作用（IC50为71.28μM）。<br>　　5.blaWUS-1基因长741bp，编码246个氨基酸，其蛋白质大小为28.64kDa。在NCBI非冗余（NR）蛋白数据库中检索WUS-1同源蛋白（氨基酸相似度大于70%）构建进化树，结果显示WUS-1与Myroidessp.Loew2-1（WP_160339331.1）染色体编码的假定B类酶相似度最高（98.37%）。与已知功能B类β-内酰胺酶相比，WUS-1与来自M.odoratimimusCIP103073的MUS-1（AAN63647.1）相似性最高（70.73%）。蛋白序列比较分析显示WUS-1有两个保守基序与Zn2+作用，Zn1结合位点由His94，His96和His157残基组成，Zn2结合位点包括Asp98，Cys176和His218氨基酸残基。<br>　　6.blaWUS-1基因与5条来自Myroidesspp.菌株的基因序列进行遗传环境分析，结果显示blaWUS-1上下游基因与携带对应基因的序列差异较大。而orfD-blaWUS-1-orfP位点相对保守，并在其两侧发现一对9-bp不完美反向重复序列（IRs）。<br>　　7.质粒pMA84474多重耐药区域有6个耐药基因和一系列可移动遗传元件密集分布，比较基因组分析结果表明，pMA84474的MDR区与香味类香味菌PR63039的质粒p63039（CP013691.1，同源性为93.69%）核苷酸序列相似度最高。5个抗性基因聚集在一个与IS91家族转座酶ISWz1序列（ISWz1-aads-blaMYO-1-IS4-ereD-ermF-blaOXA-347-intI-ISWz1）相关的可移动遗传元件相关单元中。<br>　　结论<br>　　1.本文首次报道了一株环境分离Myroidesalbus全基因组序列，并发现了一个染色体编码的新型金属β内酰胺酶基因，命名为blaWUS-1。<br>　　2.将WUS-1与现有所有功能已知的MBLs的氨基酸序列进行比对，其同源性较低，与B1类金属β-内酰胺酶MUS-1和TUS-1氨基酸相似度最高，分别为70.73%和70.32%，且具有金属酶的保守位点，因此，WUS-1可以被认为MBLs谱系中一个新的成员。<br>　　3.WUS-1与其他B1亚类MBLs功能特征高度相似，对头孢菌素类的催化效率低于青霉素类或碳青霉烯类，EDTA对酶活性有抑制作用。<br>　　4.多序列比较显示blaWUS-1上下游共21kb序列中未发现目前已知的可移动遗传元件（MGE），但blaWUS-1周围存在一对9-bp的不完美反向重复序列（IRs），提示序列变化可能是由反向重复序列介导的重排引起的。<br>　　5.质粒pMA84474与香味类香味菌PR63039菌株的质粒p63039的同源性最高（覆盖率91%，相似度99.71%），提示该质粒存在同属细菌间转移的可能。pMA84474编码的多重耐药区域与可移动遗传元件相关，5个耐药基因串联在一个可移动遗传元件相关单元中，并被一对IS91家族转座酶ISWz1序列包围，这增加了IS91介导的无需组装复合转座子介导的基因传播的可能性。