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摘要G蛋白偶联受体超家族（GProtein-CoupledReceptors,GPCRs）是重要的药物靶点，在生理状态下能以二聚体或更高级的聚合形式存在并发挥作用。其中，由不同受体相互作用形成的异源二聚体具有独特的生化特征和生理功能，在受体转运、配体结合、信号转导等方面都与单体形式的GPCR存在差异，并可能参与疾病的发生与发展。目前，靶向GPCR异源二聚体的药物研发进展缓慢，亟需GPCR异源二聚体的结构信息，帮助阐明受体异源二聚化与功能改变的联系；并以结构为基础，助力靶向GPCR异源二聚体的新型药物开发。<br>　　1型血管紧张素Ⅱ受体（AngiotensinⅡType1Receptor,AT1R）是A类GPCRs中的重要成员，在人体内介导血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的绝大部分生理效应，参与心血管功能调节并维持体液稳态，是治疗心衰以及高血压的重要药物靶点。AT1R可以在人体不同部位细胞中与多种GPCR形成异源二聚体，发挥独特功能。当AT1R与2型血管紧张素Ⅱ受体（AngiotensinⅡType2Receptor,AT2R）二聚化形成AT1R-AT2R异源二聚体后，会抑制AT1R介导的Gq信号通路，拮抗AT1R的生理功能。AT1R-AT2R异源二聚体是治疗妊娠期高血压、帕金森综合征等疾病的潜在药物靶点。与之类似，AT1R与Mas受体异源二聚化同样会抑制AngⅡ的激活作用，减少AT1R介导的磷酸肌醇产生和细胞内钙动员。而AT1R与2型缓激肽受体（BradykininType2Receptor,B2R）形成的AT1R-B2R异源二聚体，则会导致AT1R对AngⅡ的超敏反应，增强AT1R介导的Gq蛋白活化和信号转导能力，并可能导致孕妇患先兆子痫，出现妊娠期高血压。虽然研究已经证实上述三种AT1R异源二聚体的存在以及他们与疾病的关联，但是由于结构信息的缺失，靶向AT1R异源二聚体的药物仍然匮乏。目前尚无任何AT1R异源二聚体以及A类GPCR异源二聚体的结构报道。<br>　　A类GPCR异源二聚体结构解析的瓶颈在于，通过体外纯化得到稳定的二聚体蛋白样品十分困难。因此，本课题使用昆虫杆状病毒表达系统，在体外对AT1R-AT2R、AT1R-B2R和AT1R-Mas异源二聚体蛋白进行表达与纯化。尝试使用NanoBiT方法、化学诱导二聚化方法、脂质纳米盘（Nanodiscs）等促进二聚体形成的策略对受体进行改造，并通过融合蛋白筛选、末端截短、氨基酸定点突变等手段提高二聚体蛋白的表达量和稳定性。本课题为后续AT1R-AT2R、AT1R-B2R和AT1R-Mas异源二聚体的结构生物学研究以及基于AT1R异源二聚体结构的药物研发奠定基础。<br>　　针对AT1R-AT2R二聚体，本课题使用化学诱导二聚化策略中的FKBP-FRB-Rapamycin体系，对AT1R、AT2R的末端进行截短改造，并分别连接FKBP、FRB融合蛋白。同时对蛋白纯化过程中使用的去垢剂、配体、雷帕霉素进行筛选。最终得到蛋白纯度较高、均一性较好的AT1R-AT2R二聚体样品。且样品在负染电镜下表现为大小合适，形状完整的颗粒。目前正在优化纯化流程，以期二聚体蛋白在制备冷冻电镜样本时仍可保持较好的稳定性。针对AT1R-B2R二聚体，尝试使用纳米抗体、下游信号蛋白进行稳定，但效果不佳。在对化学诱导二聚化方法和NanoBiT方法进行筛选后，选择前者，在AT1R、B2R的C末端分别连接FKBP、FRB融合蛋白。并对纯化标签的插入位置、两个受体的末端长度、以及AT1R的氨基酸定点突变进行筛选，最终得到蛋白纯度较高、均一性较好的AT1R-B2R二聚体样品。目前正在进行纯化条件的筛选，以期在放大表达纯化体系时仍可通过分子筛层析分离得到稳定的二聚体蛋白。针对AT1R-Mas二聚体，对受体进行改造及对蛋白进行去糖基化处理后，得到了性质较好的二聚体样品，后续将使用大量细胞进行蛋白纯化。<br>　　综上，本课题以AT1R-AT2R、AT1R-B2R和AT1R-Mas异源二聚体为研究对象，使用多种方法稳定二聚体蛋白。最终通过体外表达和纯化，成功获得了上述三种纯度较高、均一性较好的二聚体蛋白样品，为后续使用冷冻电镜解析AT1R异源二聚体结构奠定重要基础。而结构信息将助力AT1R异源二聚体的功能研究，推动靶向AT1R异源二聚体药物的开发。