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摘要血管紧张素Ⅱ1型受体(AngiotensinⅡtype1receptor,AT1R)属于G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)超家族,是临床上治疗心血管疾病的重要靶点之一,其内源性配体为血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ).AngⅡ同时激活AT1R下游G蛋白信号通路与阻遏蛋白(arrestin)信号通路,G蛋白信号通路的激活会导致血管平滑肌收缩进而升高血压.血管紧张素受体阻滞剂(AngiotensinⅡreceptor blocker,ARB)是目前治疗高血压的主要药物之一,这类药物竞争性地拮抗AngⅡ激活的G蛋白信号从而降低血压.近年来发现偏向β-arrestin信号通路的AT1R偏向性激动剂具有心脏保护作用和治疗充血性心力衰竭的潜力,然而目前尚无此类药物成功开发.<br>　　研究表明AT1R被G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinase,GRK)磷酸化后能与β-arrestin形成极性相互作用,从而激活AT1R-β-arrestin信号通路.并且AT1R被GRK2/3/5/6磷酸化后与β-arrestin形成的复合物具有不同构象,进而激活β-arrestin介导的不同信号,产生多样的生理功能,但其分子机制暂不明确.通过解析AT1R-β-arrestin复合物结构可以帮助阐明β-arrestin偏向性信号转导的分子机制.GRK磷酸化AT1R对形成稳定的AT1R-β-arrestin复合物很关键,因此本课题纯化出AT1R、GRK、β-arrestin重组蛋白进行体外磷酸化实验,探究不同亚型GRK磷酸化AT1R的主要序列,并确定对形成稳定AT1R-β-arrestin复合物具有促进作用的GRK亚型,进而帮助AT1R-β-arrestin复合物结构解析,阐释GRK磷酸化AT1R介导的β-arrestin偏向性信号转导机制,并加快基于结构的AT1R-β-arrestin偏向性药物设计.<br>　　本课题首先纯化出GRK2/3/5/6重组蛋白,能够在体外成功磷酸化AT1R,并筛选出不同亚型GRK的适宜磷酸化条件.并发现在此条件下AT1R被GRK5磷酸化水平最高,是被GRK2/6磷酸化水平的5倍,被GRK3磷酸化水平的2倍.然后通过比较野生型和C末端突变型AT1R,鉴定GRK2/3/5/6磷酸化AT1R C末端的磷酸化序列,发现GRK5主要磷酸化332-TKMSTLS-338序列,GRK2主要磷酸化326-SHSNLS-331序列,GRK3/6主要磷酸化332-TKMSTLS-338与326-SHSNLS-331序列.体外相互作用实验(pull-down)进一步发现,与GRK2/3/6相比,被GRK5体外磷酸化后的AT1R能够与β-arrestin1形成更稳定的AT1R-β-arrestin1复合物,并且将332-TKMSTLS-338或326-SHSNLS-331序列的丝氨酸/苏氨酸突变后,复合物形成会显著减少.为了从分子层面上阐释GRK5磷酸化多肽332-TKMSTLS-338反应的结构基础,本课题初步对GRK5与多肽332-TKMSTLS-338复合物进行了高通量结晶筛选.<br>　　综上所述,本课题的研究揭示了体外纯化的AT1R重组蛋白被不同亚型GRK磷酸化的选择性分子机制,其中GRK5通过磷酸化AT1R C末端的332-TKMSTLS-338序列,具有最高的磷酸化水平,并能够使AT1R与β-arrestin1形成最稳定的复合物,从而帮助AT1R-β-arrestin1复合物结构解析和基于结构设计偏向性药物,加快靶向AT1R的抗心衰药物研发.