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摘要目的:多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS)是一种自身免疫性的中枢神经系统炎症疾病,病变最常累及白质,由于MS的发病部位难以取材,实验中常采用实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)动物模型进行研究.研究表明Th17/Treg细胞分化平衡与MS及EAE的发生发展密切相关,Th17/Treg比值降低能够缓解疾病进展.Th17和Treg细胞作为一对相互拮抗的CD4+T细胞亚群,其分化与活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平有关.本课题组前期研究发现Treg细胞比Th17细胞更偏好高ROS环境.线粒体是细胞内ROS的主要产生场所,在CD4+T细胞中敲除线粒体基因Lonp1或Tid1也许能影响ROS水平.然而,在CD4+T细胞中敲除上述基因对CD4+T细胞分化及EAE的影响尚未有文献报道.本研究旨在应用Cre-lox系统构建CD4+T细胞中线粒体基因Lonp1或Tid1条件性敲除(Conditional knockout,CKO)小鼠模型,为后续研究Lonp1或Tid1在CD4+T细胞中敲除后,是否能影响ROS水平及影响Th17、Treg细胞的分化,最终缓解EAE的进程提供基础.<br>　　方法:1、纯化CD4+T细胞,流式检测Th17、Treg细胞比例.构建EAE动物模型,观察绘制临床评分图,苏木精—伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察小鼠脊髓中炎性细胞浸润情况.<br>　　2、使用PCR技术检测鉴定亲代及子代小鼠基因型,并对其进行挑选繁育.使用Cre-lox重组系统实现在CD4+T细胞中条件性敲除线粒体基因Lonp1或Tid1,通过Western blot(WB)、qPCR技术确认CD4+T细胞中Lonp1或Tid1是否成功敲除.<br>　　3、分离Lonp1敲除鼠的CD4+T细胞进行Th17、Treg分化及流式检测.<br>　　结果:1、成功建立Th17、Treg细胞分化条件及构建EAE动物模型.<br>　　2、PCR检测CD4cre×Lonp1flox及CD4cre×Tid1flox小鼠子代基因型,通过WB及qPCR检测表明Lonp1或Tid1在CD4+T细胞中成功敲除.<br>　　3、流式检测表明,与WT组相比,CD4+T中Lonp1敲除不影响主要淋巴器官中T细胞的发育,但抑制CD4+T细胞增殖,同时抑制Th17细胞分化而促进Treg细胞分化,显著降低了Th17/Treg比值.<br>　　结论:1、成功构建CD4+T细胞Lonp1或Tid1条件性基因敲除小鼠.<br>　　2、Lonp1在CD4+T细胞中敲除后不影响主要淋巴器官脾脏、淋巴结及胸腺中T细胞的发育,抑制CD4+T细胞增殖,抑制Th17细胞分化而促进Treg细胞分化,显著降低了Th17/Treg比值.