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摘要细胞焦亡（Pyroptosis）通过促进炎症因子的释放和炎症反应的发生参与动脉粥样硬化（Atherosclerosis, As）的发生发展。氧化脂蛋白(a) [oxidized lipoprotein(a), oxLp(a)]被认为比天然脂蛋白(a)更具致动脉粥样硬化形成作用。oxLp(a)可以促进内皮细胞活性氧簇（Reactive oxygen species, ROS）的生成增多，但是其机理目前尚不清楚。线粒体是 ROS生成的主要场所，线粒体电子呼吸传递链复合物Ⅰ和复合物Ⅲ功能障碍是线粒体活性氧簇（ mitochondria reactive oxygen species, mtROS）生成的主要方式。细胞色素 b（Cytochrome b, CYTB）蛋白为呼吸链复合物Ⅲ的重要组份，参与电子传递过程。我们推测 oxLp(a)可能通过促进 mtROS的生成从而诱发血管内皮细胞（ Vascular endothelial cells, VECs ）焦亡的发生，并且 oxLp(a)可能通过调控 CYTB表达水平诱导释放 mtROS促 VECs焦亡。CYTB启动子区域有 CpG岛的存在，因此 TET甲基胞嘧啶双加氧酶 2 （ TET methyl cytosine dioxygenase 2 ,TET2 ）参与通过线粒体DNA（mtDNA）甲基化修饰调控线粒体功能。本研究拟干预 TET2、CYTB及 mtROS ，分析细胞焦亡以及线粒体功能的变化，探讨TET2-CYTB-mtROS途径在 oxLp(a)诱发脐静脉内皮细胞（ human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）焦亡中的作用，并在 apoE-/-小鼠上研究 oxLp(a)的促 As作用。<br>　　目的：探讨 oxLp(a)诱发 HUVECs焦亡和促 As的新机制<br>　　方法：HUVECs经 100 μg/mL oxLp(a)孵育 24 h后，通过蛋白质印迹、ELISA和 qRT-PCR检测焦亡相关蛋白表达及促炎细胞因子水平；扫描电镜检测血管内皮细胞膜破裂情况；Hoechst 33342/PI染色检测细胞凋亡情况。通过蛋白质印迹检测了线粒体相关蛋白核呼吸因子 1（Nuclear Respiratory Factor 1，NRF1）、核呼吸因子 2 和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α（Peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α）的表达水平；用透射电子显微镜，mtROS探针和 Flou-4AM分别对线粒体形态和功能进行检测。分别转染CYTBsiRNA和 CYTB过表达慢病毒，蛋白质印迹检测其转染效率和转染后细胞焦亡相关蛋白的表达变化。构建TET2低表达和过表达的慢病毒载体，用蛋白质印迹检测 CYTB表达的变化，焦亡相关蛋白表达及促炎细胞因子水平；Hoechst 33342/PI染色检测 PI阳性细胞染色情况。通过免疫荧光检测 oxLp(a)处理的细胞内 5hmc含量百分比，来评估oxLp(a)对细胞内甲基化总体水平的影响。用尾静脉注射方法每周向 apoE-/-小鼠注射 100 μg/kg的oxLp(a)。16周后取小鼠的心脏组织和主动脉做油红 O ，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色及用体式显微镜来评估动脉粥样硬化斑块的面积情况。<br>　　结果：经 OxLp(a)处理后，蛋白质印迹检测发现焦亡相关分子 NLRP3（P＜0.001）、N-GSDMD（P＜0.001）、GSDMD（P＜0.001）和 Pro-caspase-1（P＜0.05）表达水平显著升高，而 CYTB（P＜0.05）和 TET2 （ P＜0.05 ）的蛋白表达水平显著降低；ELISA检测发现促炎细胞因子 IL-1β（P＜0.001）和 IL-18（P＜0.001）水平均显著升高， qRT-PCR检测促炎细胞因子 IL-1β（P＜0. 001）、IL-18（P＜0.05）和caspase-1（P＜0.01）水平均显著升高。扫描电镜结果显示细胞膜上出现许多细小裂孔，Hoechst 33342/PI染色发现其阳性染色百分比增加（ P＜0.01 ）。并且， oxLp(a)可抑制 HUVECs线粒体相关蛋白PGC-1α（ P＜0.001 ）、NRF1 （ P＜0.001 ）和 NRF2 （ P＜0.01 ）表达水平，促线粒体功能紊乱。通过 MitoSOX和 Flou-4AM发现 oxLp(a)条件下 HUVECs中的 mtROS生成增加（P＜0.001），Ca2+超载发生（P＜0.001），提示线粒体功能受损。透射电子显微镜显示 HUVECs线粒体形态异常。沉默 CYTB 后焦亡相关蛋白以及 IL-1β（ P＜0.001 ）、IL-18 （ P＜0.001 ）水平增加。但可被 ROS清除剂MitoTEMPO的预处理逆转。过表达 CYTB可以逆转 oxLp(a)的作用，促进细胞焦亡相关蛋白表达及 IL-1β（P＜0.001）、IL-18（P＜0.001）水平、细胞凋亡数量（P＜0.01）、Ca2+水平（P＜0.01）、mtROS水平（P＜0.001）。过表达 TET2可以抑制 oxLp(a)促 HUVECs细胞焦亡及相关分子表达，降低炎性因子 IL-1β（P＜0.01）、IL-18（P＜0.01）水平、减少细胞凋亡数量（ P＜0.001 ）、及 Ca2+水平（ P＜0.01 ）、mtROS水平（ P＜0.001 ）。并且还发现 TET2低表达（ P＜0.05 ）时CYTB表达下降（P＜0.05）；TET2过表达（P＜0.05）时 CYTB表达增加（P＜0.01）。HUVECs的 5hmc免疫荧光表明，oxLp(a)处理的细胞其 5hmc 含量显著降低（ P＜0.01 ），证明 oxLp(a)可以增加HUVECs的总体甲基化水平。体内实验表明，经 oxLp(a)处理的apoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积高于对照组(P＜0.001) ，证明oxLp(a)可以加剧 As病变。<br>　　结论：1. oxLp(a)诱发 HUVECs焦亡及线粒体功能障碍；2. oxLp(a)通过 TET2-CYTB-mtROS 途径诱发 HUVECs 焦亡；3. oxLp(a)促进 apoE-/-小鼠 As病变。