摘要细胞焦亡(Pyroptosis)通过促进炎症因子的释放和炎症反应的发生参与动脉粥样硬化(Atherosclerosis, As)的发生发展。氧化脂蛋白(a) [oxidized lipoprotein(a), oxLp(a)]被认为比天然脂蛋白(a)更具致动脉粥样硬化形成作用。oxLp(a)可以促进内皮细胞活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)的生成增多,但是其机理目前尚不清楚。线粒体是 ROS生成的主要场所,线粒体电子呼吸传递链复合物Ⅰ和复合物Ⅲ功能障碍是线粒体活性氧簇( mitochondria reactive oxygen species, mtROS)生成的主要方式。细胞色素 b(Cytochrome b, CYTB)蛋白为呼吸链复合物Ⅲ的重要组份,参与电子传递过程。我们推测 oxLp(a)可能通过促进 mtROS的生成从而诱发血管内皮细胞( Vascular endothelial cells, VECs )焦亡的发生,并且 oxLp(a)可能通过调控 CYTB表达水平诱导释放 mtROS促 VECs焦亡。CYTB启动子区域有 CpG岛的存在,因此 TET甲基胞嘧啶双加氧酶 2 ( TET methyl cytosine dioxygenase 2 ,TET2 )参与通过线粒体DNA(mtDNA)甲基化修饰调控线粒体功能。本研究拟干预 TET2、CYTB及 mtROS ,分析细胞焦亡以及线粒体功能的变化,探讨TET2-CYTB-mtROS途径在 oxLp(a)诱发脐静脉内皮细胞( human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)焦亡中的作用,并在 apoE-/-小鼠上研究 oxLp(a)的促 As作用。<br> 目的:探讨 oxLp(a)诱发 HUVECs焦亡和促 As的新机制<br> 方法:HUVECs经 100 μg/mL oxLp(a)孵育 24 h后,通过蛋白质印迹、ELISA和 qRT-PCR检测焦亡相关蛋白表达及促炎细胞因子水平;扫描电镜检测血管内皮细胞膜破裂情况;Hoechst 33342/PI染色检测细胞凋亡情况。通过蛋白质印迹检测了线粒体相关蛋白核呼吸因子 1(Nuclear Respiratory Factor 1,NRF1)、核呼吸因子 2 和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α)的表达水平;用透射电子显微镜,mtROS探针和 Flou-4AM分别对线粒体形态和功能进行检测。分别转染CYTBsiRNA和 CYTB过表达慢病毒,蛋白质印迹检测其转染效率和转染后细胞焦亡相关蛋白的表达变化。构建TET2低表达和过表达的慢病毒载体,用蛋白质印迹检测 CYTB表达的变化,焦亡相关蛋白表达及促炎细胞因子水平;Hoechst 33342/PI染色检测 PI阳性细胞染色情况。通过免疫荧光检测 oxLp(a)处理的细胞内 5hmc含量百分比,来评估oxLp(a)对细胞内甲基化总体水平的影响。用尾静脉注射方法每周向 apoE-/-小鼠注射 100 μg/kg的oxLp(a)。16周后取小鼠的心脏组织和主动脉做油红 O ,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色及用体式显微镜来评估动脉粥样硬化斑块的面积情况。<br> 结果:经 OxLp(a)处理后,蛋白质印迹检测发现焦亡相关分子 NLRP3(P<0.001)、N-GSDMD(P<0.001)、GSDMD(P<0.001)和 Pro-caspase-1(P<0.05)表达水平显著升高,而 CYTB(P<0.05)和 TET2 ( P<0.05 )的蛋白表达水平显著降低;ELISA检测发现促炎细胞因子 IL-1β(P<0.001)和 IL-18(P<0.001)水平均显著升高, qRT-PCR检测促炎细胞因子 IL-1β(P<0. 001)、IL-18(P<0.05)和caspase-1(P<0.01)水平均显著升高。扫描电镜结果显示细胞膜上出现许多细小裂孔,Hoechst 33342/PI染色发现其阳性染色百分比增加( P<0.01 )。并且, oxLp(a)可抑制 HUVECs线粒体相关蛋白PGC-1α( P<0.001 )、NRF1 ( P<0.001 )和 NRF2 ( P<0.01 )表达水平,促线粒体功能紊乱。通过 MitoSOX和 Flou-4AM发现 oxLp(a)条件下 HUVECs中的 mtROS生成增加(P<0.001),Ca2+超载发生(P<0.001),提示线粒体功能受损。透射电子显微镜显示 HUVECs线粒体形态异常。沉默 CYTB 后焦亡相关蛋白以及 IL-1β( P<0.001 )、IL-18 ( P<0.001 )水平增加。但可被 ROS清除剂MitoTEMPO的预处理逆转。过表达 CYTB可以逆转 oxLp(a)的作用,促进细胞焦亡相关蛋白表达及 IL-1β(P<0.001)、IL-18(P<0.001)水平、细胞凋亡数量(P<0.01)、Ca2+水平(P<0.01)、mtROS水平(P<0.001)。过表达 TET2可以抑制 oxLp(a)促 HUVECs细胞焦亡及相关分子表达,降低炎性因子 IL-1β(P<0.01)、IL-18(P<0.01)水平、减少细胞凋亡数量( P<0.001 )、及 Ca2+水平( P<0.01 )、mtROS水平( P<0.001 )。并且还发现 TET2低表达( P<0.05 )时CYTB表达下降(P<0.05);TET2过表达(P<0.05)时 CYTB表达增加(P<0.01)。HUVECs的 5hmc免疫荧光表明,oxLp(a)处理的细胞其 5hmc 含量显著降低( P<0.01 ),证明 oxLp(a)可以增加HUVECs的总体甲基化水平。体内实验表明,经 oxLp(a)处理的apoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积高于对照组(P<0.001) ,证明oxLp(a)可以加剧 As病变。<br> 结论:1. oxLp(a)诱发 HUVECs焦亡及线粒体功能障碍;2. oxLp(a)通过 TET2-CYTB-mtROS 途径诱发 HUVECs 焦亡;3. oxLp(a)促进 apoE-/-小鼠 As病变。
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