摘要目的:鼻咽癌属头颈部恶性肿瘤,放疗为其主要治疗手段。提高鼻咽癌放疗敏感性对其治疗具有极大临床意义。本课题旨在前期研究基础上探讨STGC3基因高表达对鼻咽癌HONE1细胞放射敏感性的影响及可能的分子机制。<br> 方法:1.使用瞬时转染技术让空载体质粒(RFP)和STGC3高表达质粒(RFP-STGC3)转进HONE1细胞,借助于荧光显微镜来观察细胞中荧光情况,Westernblot技术检测HONE1、HONE1-RFP和HONE1-RFP-STGC3三组细胞STGC3蛋白表达水平,评估转染效果。2.使用固定源皮距照射法,对HONE1组、HONE1-RFP组和HONE1-RFP-STGC3组细胞进行照射。3.采用平板克隆实验检测经总剂量为0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy照射后的HONE1、HONE1-RFP和HONE1-RFP-STGC3三组细胞克隆形成能力,通过多靶单击模型评测细胞放射敏感性。4.运用CCK-8法实验分析比较经放疗后HONE1、HONE1-RFP和HONE1-RFP-STGC3三组细胞增殖率。5.机制研究中,WesternBlot技术检测放射后HONE1、HONE1-RFP和HONE1-RFP-STGC3三组细胞p-mTOR、mTOR、p70S6K、p-p70S6K、LC3、p62蛋白的表达水平。6.使用雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)处理HONE1-RFP-STGC3组,干扰通路的激活,进行回复实验,分为HONE1组、HONE1-RFP组、HONE1-RFP-STGC3组、HONE1-RFP-STGC3+RAPA组,同时进行放射处理。WesternBlot检测各组细胞p-mTOR、mTOR、p70S6K、p-p70S6K、p62蛋白表达水平,划痕实验和Transwell实验检测各组细胞迁移能力,平板克隆实验检测各组细胞克隆形成能力。<br> 结果:1.将质粒转入HONE1细胞后,荧光显微镜下细胞内可见红色荧光。2.WesternBlot结果显示,HONE1-RFP-STGC3组中STGC3蛋白表达水平显著高于HONE1-RFP组和HONE1组(p<0.05),表明STGC3高表达HONE1细胞系(HONE1-RFP-STGC3)和空载体HONE1细胞系(HONE1-RFP)构建成功。3.HONE1组、HONE1-RFP组和HONE1-RFP-STGC3组细胞进行照射处理后,平板克隆实验结果显示各放射组在不同放射剂量条件下HONE1-RFP-STGC3组克隆形成能力低于HONE1-RFP组和HONE1组(p<0.05)。4.多靶单击模型结果显示HONE1-RFP-STGC3组细胞存活曲线较HONE1-RFP组和HONE1组明显下移,提示STGC3能增强HONE1细胞放射敏感性。5.HONE1组、HONE1-RFP组和HONE1-RFP-STGC3组细胞放射后CCK-8实验结果显示HONE1-RFP-STGC3组细胞增殖能力较HONE1组和HONE1-RFP组低(p<0.05),表明STGC3高表达能显著抑制放射后HONE1细胞增殖能力。6.HONE1组、HONE1-RFP组和HONE1-RFP-STGC3组细胞经放射后,WesternBlot结果显示HONE1-RFP-STGC3组p-mTOR、p-p70S6K的蛋白表达明显高于HONE1-RFP组及HONE1组(p<0.05),表明STGC3能促进mTOR、p70S6K的磷酸化水平;HONE1-RFP-STGC3组中蛋白LC3-Ⅱ表达量明显低于HONE1组及HONE1-RFP组(p<0.05),HONE1-RFP-STGC3组蛋白p62表达量明显高于HONE1组及HONE1-RFP组(p<0.05),提示STGC3可能抑制放射后HONE1细胞自噬。7.用RAPA处理经放射后的HONE1-RFP-STGC3组,WesternBlot检测结果显示HONE1-RFP-STGC3+RAPA组蛋白p-P70S6K、p-mTOR的表达量较HONE1-RFP-STGC3组低(p<0.05),表明RAPA能拮抗STGC3促进的mTOR和p70S6K蛋白的磷酸化;HONE1-RFP-STGC3+RAPA组蛋白p62表达量较HONE1-RFP-STGC3组下降(p<0.05),表明高表达STGC3的HONE1细胞用RAPA处理后,其细胞自噬水平提高。8.划痕试验和Transwell实验显示HONE1-RFP-STGC3+RAPA组细胞迁移能力相对HONE1-RFP-STGC3组增强(p<0.05),且平板克隆试验显示HONE1-RFP-STGC3+RAPA组细胞克隆形成能力相对HONE1-RFP-STGC3组增强(p<0.05),提示RAPA能拮抗STGC3对放射后HONE1细胞迁移和克隆形成能力的影响。<br> 结论:STGC3高表达能增加鼻咽癌HONE1细胞的放疗敏感性,其机制可能与抑制mTOR信号介导的细胞自噬有关。
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