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摘要【目的】本研究旨在探讨白杨素在胃癌细胞中诱导凋亡和自噬及其作用机制。<br>　　【方法】<br>　　1.使用CCK8法检测白杨素分别处理各种胃癌细胞（MGC-803、BGC-823、HGC-27、SGC-7901、AGS）及正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）24小时、48小时和72小时后对细胞活力的抑制情况，从而筛选出合适的实验细胞株及白杨素最佳作用浓度和作用时间。EDU增殖实验检测不同浓度白杨素（0、10、20、40和60μg/mL）和5-FU（10、20μg/mL）处理胃癌MGC-803、HGC-27细胞48小时后对细胞增殖能力的影响。<br>　　2.使用流式细胞术检测不同浓度白杨素（0、10、20、40和60μg/mL）和5-FU（10、20μg/mL）处理胃癌MGC-803、HGC-27细胞48小时后的凋亡细胞比例。WesternBlot检测不同浓度白杨素（0、10、20、40和60μg/mL）和5-FU（10、20μg/mL）处理胃癌MGC-803、HGC-27细胞48小时后细胞中Bcl-2、Bax和cleaved-PARP蛋白的表达水平。<br>　　3.使用WesternBlot检测不同浓度白杨素（0、10、20、40和60μg/mL）和5-FU（10、20μg/mL）处理胃癌MGC-803、HGC-27细胞48小时后细胞中LC3-Ⅱ、P62和Beclin-1蛋白的表达情况。通过透射电镜观察白杨素（30μg/mL）和5-FU（20μg/mL）处理胃癌MGC-803、HGC-27细胞48小时后细胞中的超微自噬结构。分别使用吖啶橙染色定性法和流式荧光定量法检测白杨素（30μg/mL）和5-FU（20μg/mL）处理胃癌MGC-803、HGC-27细胞48小时后自噬的水平。<br>　　4.通过荧光探针DCFH-DA在荧光显微镜下观察不同浓度白杨素（0、10、20、40和60μg/mL）和5-FU（10、20μg/mL）处理胃癌MGC-803、HGC-27细胞48小时后细胞中活性氧水平的变化及经抗氧化剂NAC预处理后活性氧水平的变化。<br>　　5.使用荧光线粒体探针JC-1测量不同浓度白杨素（0、10、20、40和60μg/mL）和5-FU（10、20μg/mL）处理胃癌MGC-803、HGC-27细胞48小时后线粒体膜电位的变化。<br>　　6.使用CCK8法及流式细胞术检测抗氧化剂NAC预处理对细胞活力和细胞凋亡水平的影响。使用WesternBlot检测NAC预处理对细胞中Bcl-2、Bax、cleaved-PARP、CytC、LC3-Ⅱ、P62和Beclin-1蛋白表达水平的影响。<br>　　7.使用WesternBlot检测不同浓度白杨素（0、10、20、40和60μg/mL）和5-FU（10、20μg/mL）处理胃癌MGC-803、HGC-27细胞48小时后对细胞中AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白表达水平的影响。使用WesternBlot检测PI3K抑制剂LY294002预处理对胃癌MGC-803、HGC-27细胞中AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Bcl-2、Bax、cleaved-PARP、LC3-Ⅱ、P62和Beclin-1蛋白表达水平的影响。使用WesternBlot检测NAC预处理对细胞中AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白表达水平的影响。<br>　　8.使用流式细胞术检测白杨素（30μg/mL）和5-FU（20μg/mL）单独或联合自噬抑制剂3-MA和自噬激动剂Rapamycin后对胃癌MGC-803、HGC-27细胞凋亡水平的影响。使用WesternBlot检测白杨素（30μg/mL）和5-FU（20μg/mL）单独或联合自噬抑制剂3-MA和自噬激动剂Rapamycin后对胃癌MGC-803、HGC-27细胞中Bcl-2、Bax和cleaved-PARP蛋白表达水平的影响。<br>　　【结果】<br>　　1.白杨素随着药物浓度及作用时间的增加显著抑制MGC-803、BGC-823、HGC-27、SGC-7901、AGS五种人胃癌细胞的细胞活力，其中胃癌MGC-803和HGC-27细胞的IC50值处于所有人胃癌细胞系的中间水平，而正常人胃黏膜上皮细胞系GES-1对白杨素表现出更高的耐受性。使用30μg/mL的白杨素处理胃癌MGC-803和HGC-27细胞48小时能够达到最佳的抑制效果。<br>　　2．白杨素和5-FU以浓度依赖性方式增加了胃癌MGC-803和HGC-27细胞的凋亡细胞比例。随着白杨素和5-FU作用浓度的增加，凋亡相关蛋白Bax和cleaved-PARP的表达水平显著上调，Bcl-2蛋白表达水平显著下调。<br>　　3.白杨素和5-FU以浓度依赖性方式上调了胃癌MGC-803和HGC-27细胞中自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达水平。透射电镜结果显示白杨素和5-FU处理胃癌MGC-803和HGC-27细胞48小时后都出现了明显的双层膜自噬小体结构。吖啶橙染色结果显示白杨素和5-FU处理胃癌MGC-803和HGC-27细胞48小时后，胞质内都出现了吖啶橙富集的亮红色酸性囊泡。<br>　　4.白杨素和5-FU以浓度依赖性方式增加了胃癌MGC-803和HGC-27细胞内的活性氧水平，而这可能是由线粒体损伤引起的。CCK8和流式细胞术的结果显示，抗氧化剂NAC预处理不仅恢复了白杨素和5-FU抑制的胃癌MGC-803和HGC-27细胞的细胞活力，还减少了胃癌MGC-803和HGC-27细胞的凋亡细胞比例。WesternBlot结果显示，NAC预处理下调了胃癌MGC-803和HGC-27细胞内凋亡相关蛋白Bax、cleaved-PARP、CytC和自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1的蛋白表达水平，上调了Bcl-2蛋白表达水平。<br>　　5.白杨素和5-FU处理胃癌MGC-803和HGC-27细胞后，下调了细胞中p-AKT、p-mTOR的蛋白表达水平，而对AKT、mTOR的蛋白表达水平没有影响。PI3K抑制剂LY294002预处理进一步下调了细胞中p-AKT、p-mTOR的蛋白表达水平的同时还明显上调了凋亡相关蛋白Bax、cleaved-PARP和自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1的蛋白表达水平，下调了Bcl-2的蛋白表达水平。而抗氧化剂NAC预处理则恢复了白杨素和5-FU下调的p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平。<br>　　6.流式细胞术的结果显示，自噬抑制剂3-MA与白杨素或5-FU联合应用都可以增加胃癌MGC-803和HGC-27细胞的凋亡细胞比例。WesternBlot结果显示，自噬抑制剂3-MA与白杨素或5-FU联合应用都上调了细胞中凋亡相关蛋白Bax、cleaved-PARP的蛋白表达水平，下调了Bcl-2的蛋白表达水平。而自噬激活剂Rapamycin与白杨素或5-FU联合应用的作用则相反。<br>　　【结论】<br>　　本研究表明白杨素通过抑制AKT/mTOR信号通路在胃癌MGC-803、HGC-27细胞中诱导了凋亡和自噬，而这一过程是由活性氧介导的。此外，白杨素联合自噬抑制剂3-MA可以增加白杨素诱导的胃癌MGC-803、HGC-27细胞凋亡水平。